Гамма автоцентр: Официальный дилер УАЗ в Ростове – компания Сокол Моторс

Поделиться

Гамма Эксперт на Кушелевской дороге +7 996 774-79-98 г Санкт-Петербург, Кушелевская дорога, д 20

Авто Гамма, автоцентр на карте Санкт-Петербурга ул. Кушелевская дорога, 20

Карта С.-Петербурга

Добавить логотип

улица Набережная реки Мойки, 110

улица 14-я линия В. О., 5

улица Ленина (Шушары), 2

улица 4-я линия В.О., 59

улица Малая Морская, 19

Зарегистрировать компанию

Убрать рекламу

1 отзыв

Санкт-Петербург,
улица Кушелевская дорога, 20

8 (812) 777-03-53

7770353@avto-gamma. ru

Как доехать на общественном транспорте:

(общественный транспорт Санкт-Петербурга online)

• Малая Морская (Невский проспект) (~163м)
• Дворцовая пл. (~229м)
• Малая Морская (ул. Гороховая) (262м)

Ближайшие станции метро:

• Адмиралтейская (198м)
• Невский проспект (1023м)
• Гостиный Двор (1260м)

http://www. avto-gamma.ru

Последний отзыв:

Достоинства

Цены

Недостатки

Нет

Комментарий

Приезжал в этот салон на ТО. Хочется отметить высокий уровень обслуживания. На время ожидания менеджеры предложили комнату ожидания. Можно сидеть и заниматься своими делами. Даже не заметил, как подош… далее

• Автосалоны;
• Автозапчасти;
• Кузовной ремонт

Данные об организации «Авто Гамма, автоцентр» размещены в справочнике Санкт-Петербурга в рубриках «Автосалоны», «Автозапчасти», «Кузовной ремонт». «Авто Гамма, автоцентр» зарегистрирована по адресу Санкт-Петербург, улица Кушелевская дорога, 20. Сайт http://www.avto-gamma.ru

Сообщить об ошибке

Есть вещи, какие созданы друг для друга, стоит ли искать им замену?Надежность и длительный срок службы авто имеют возможность обеспечить лишь оригинальные детали. Разработанные, протестированные и испытанные специалистами фирмы они обеспечивают безопасную и долговечную эксплуатацию Вашего авто.Потому применение оригинальных деталей – это залог полноценной и безопасной работы вашего авто. Созданные со знанием дела, защищенные уникальным дизайном упаковки, маркировками и штрих-кодом, они обеспечивают стабильную и безаварийную работу. Центр сервисного обслуживания нашей фирмы располагает собственным складом оригинальных деталей и аксессуаров . При отсутствии нужной детали на складе, она будет поставлена в макс. короткие сроки с центрального склада в Москве либо Германии. Наши работники службы сервиса доверяют лишь оригинальным деталям . На установленные нашим центром сервисного обслуживания оригинальные детали распространяется гарантия.Фирма сможет обеспечивать эксплуатацию Вашего авто лишь при условии применения Вами исключительно оригинальных деталей .

Добавить/Редактировать описание

«Авто Гамма» на карте Санкт-Петербурга

Добавить фотографии

Просмотров этого минисайта: 1 (вчера) / 1 (за октябрь) / 1 (365 дней)

Раскрыта моторная гамма нового Dacia Duster – Автоцентр.ua

Автоцентр Новости Раскрыта моторная гамма нового Dacia Duster

Марка

Модель

Оставьте ваши контактные данные:

По телефону

На почту

Уточните удобное время для звонка:

День/дата

• День/дата
• Сегодня
• Завтра
• 10
• 11
• 12
• 13
• 14
• 15

Часы

• 8
• 9
• 10
• 11
• 12
• 13
• 14
• 15
• 16
• 17
• 18
• 19
• 20

Минуты

• 10
• 20
• 30
• 40
• 50

Отправляя заявку я предоставляю свое согласие на сбор и обработку предоставленных мною личных персональных данных в соответствии с Законом Украины «О защите персональных данных»

Оставьте ваши контактные данные:

Уточните удобное время для звонка:

День/дата

• День/дата
• Сегодня
• Завтра
• 10
• 11
• 12
• 13
• 14
• 15

Часы

• 8
• 9
• 10
• 11
• 12
• 13
• 14
• 15
• 16
• 17
• 18
• 19
• 20

Минуты

• 10
• 20
• 30
• 40
• 50

Прямо сейчас

Отправляя заявку я предоставляю свое согласие на сбор и обработку предоставленных мною личных персональных данных в соответствии с Законом Украины «О защите персональных данных»

Оставьте ваши контактные данные:

Выберите машину:

Марка

• Сначала выберите дилера

Модель

• Сначала выберите марку

Отправляя заявку я предоставляю свое согласие на сбор и обработку предоставленных мною личных персональных данных в соответствии с Законом Украины «О защите персональных данных»

Sample Text

Оставьте ваши контактные данные:

Выберите машину:

Марка

• Сначала выберите дилера

Модель

• Сначала выберите марку

Уточните удобное время для тест-драйва:

День/дата

• День/дата
• Сегодня
• Завтра
• 10 октября
• 11 октября
• 12 октября
• 13 октября
• 14 октября
• 15 октября
• 16 октября
• 17 октября
• 18 октября
• 19 октября
• 20 октября
• 21 октября
• 22 октября

Часы

• 8
• 9
• 10
• 11
• 12
• 13
• 14
• 15
• 16
• 17
• 18
• 19
• 20

Минуты

• 00
• 10
• 20
• 30
• 40
• 50

Отправляя заявку я предоставляю свое согласие на сбор и обработку предоставленных мною личных персональных данных в соответствии с Законом Украины «О защите персональных данных»

X

Оберіть мовну версію сайту. За замовчуванням autocentre.ua відображається українською мовою.

Слава Україні! Героям слава!
Ви будете перенаправлені на українську версію сайту через 10 секунд

Aptera представляет интерьер автомобиля Gamma (почти серийный)

Недавний пост Aptera в социальных сетях показывает, что компания добилась значительного прогресса в создании своего серийного автомобиля. Мало того, что Aptera находится на последнем этапе перед производственным проектированием, они еще и полностью оснастили его интерьером и экстерьером (чего не было сделано на последнем этапе производства).

Aptera, калифорнийский производитель электромобилей, находится в самом разгаре производственного процесса, состоящего из четырех этапов. Эти фазы до сих пор были известны как Альфа, Бета и Гамма. Автомобили Alpha были первой пробной версией компании, которая, как они знали, выявит множество проблем. Бета-автомобили служили незаконченными демонстрационными автомобилями для тестирования технологических улучшений для устранения крупных ошибок. Серийные кандидаты для фазы Gamma почти завершены и позволяют им сгладить производственные проблемы в последнюю минуту, тогда как серийные автомобили будут фазой Delta.

Итак, то, как автомобили Gamma воплощаются в жизнь, показывает нам, что Aptera приближается к реальному производству.

Это здесь, и это лучше, чем когда-либо. #Гамма pic.twitter.com/nhu61sriIF

— Aptera (@aptera_motors) 5 августа 2022 г.

На этих фотографиях сразу бросается в глаза несколько вещей.

Во-первых, мы видим, что они придерживаются простого/минималистского интерьера в стиле Tesla. Я знаю, что это не для всех (я лично больше люблю кнопки), но все равно выглядит очень четко.

Старый дизайн интерьера Aptera. Изображение предоставлено Aptera.

По сравнению с этим более ранним дизайном мы видим, что Gamma отказалась от тканевого дизайна в пользу более гладкого, похожего на кожу материала внутренней отделки, как у Tesla.

В связи с этим я заметил, что несколько человек в социальных сетях выражали свое разочарование решением Aptera использовать ярмо, а также ее решением скопировать внутренний дизайн Tesla. Я лично думаю, что это может быть правдой (обратите внимание, что я сказал «может», потому что я не знаю наверняка), или что отношения Aptera с Munro & Associates могли привести их к тому, что они последовали за Теслой (Сэнди Манро стал большим поклонником Тесла в последнее время), и я не единственный, кто обдумывал это. Поскольку люди не любят Теслу по ряду причин, добавление идеи о том, что Aptera слепо следует за Теслой, само по себе вызывает напряжение.

В то же время мы видим, что они все еще делают то, что явно принадлежит Aptera. Например, ярмо более круглое и больше сверху вниз, чем ярмо Tesla, что может привести к реальным функциональным различиям, которые делают его лучшим выбором, чем у Tesla. Глядя на сиденье, они определенно отошли от ортодоксальности Tesla и сделали что-то, что больше соответствует истории развития автомобиля, чем шаблону Tesla.

Еще одно огромное отличие от старых моделей Aptera, которое я заметил, заключается в том, что запас по высоте значительно увеличен. Всегда было место для головы более высоких людей, даже в Альфах, но у них была большая проблема с частями крыши, находящимися в поле зрения водителя. Здесь мы видим, что они значительно улучшили видимость для более высоких людей, и что почти каждый будет хорошо помещаться в автомобиле и будет в безопасности.

Мы также можем видеть, что Aptera утвердилась в дизайне с двумя экранами. Поклонники дизайна Model 3 с одним экраном, в котором полностью отсутствует какая-либо традиционная приборная панель за рулем, подумают, что Aptera сделала здесь неверный шаг, но они, вероятно, не знают, что Aptera планирует использовать камеры вместо боковых. зеркала для максимальной аэродинамической эффективности.

У этих камер где-то должен быть экран, поэтому у Aptera должно было быть больше экранной недвижимости, которая не находилась бы в неловком положении, чтобы не путать левое и правое. Единственный логичный способ сделать это — расположить их по центру перед водителем, если только экраны не собираются располагаться по бокам у дверей.

Остается один открытый вопрос: будет ли зеркальный дисплей Aptera делать что-то еще. Я знаю, что хотел бы иметь на этом дисплее спидометр и, возможно, некоторые другие настраиваемые пользователем характеристики автомобиля, очень похожие на приборную панель, но мы не знаем, предоставит ли Aptera такую ​​возможность на данный момент.

Еще одна вещь, которая была очевидна с самого начала, это то, что внутри автомобиля обычно много места. Вы могли бы подумать, что небольшой автомобиль, вмещающий двух человек, будет тесным, но когда вам не нужно сажать людей за двигатель внутреннего сгорания, вы можете гибко раскладывать вещи. Поскольку в Aptera используются мотор-колеса, внутри достаточно места для людей, даже если на фотографиях автомобиль выглядит маленьким.

На самом деле, это широкое транспортное средство, поэтому людям, которые не видели Aptera вблизи, необходимо изменить настройки масштабирования в своем мозгу, чтобы действительно иметь представление о том, на что это похоже.

Что мы можем ожидать дальше

Честно говоря, мы, вероятно, не увидим большой разницы между Гаммой (транспортное средство на изображениях) и Дельтой, следующей и последней фазой. С этого момента до Delta они будут вносить только те коррективы, которые необходимы, чтобы сделать автомобиль более эффективным и быстрым. Это то, над чем они работали с Манро уже довольно давно, поэтому изменения могут быть либо невидимы для нас, либо их очень трудно увидеть. Я предполагаю, что я не смог бы обнаружить их, если бы у меня не было Гаммы и Дельты рядом.

Но это всего лишь предположение. Как сказал мне однажды инструктор по огнестрельному оружию, «в конечной баллистике нет никаких гарантий». Или, если вы не любитель оружия, основная идея та же, что и «Это еще не конец, пока толстая дама не споет». Команда Aptera может действительно думать, что они все выяснили, но должны внести заметные изменения между настоящим моментом и Delta, чтобы машину было легче запускать в массовом порядке.

Aptera прошла долгий путь, но впереди большие испытания

Должен признаться, что, когда Aptera впервые восстала из мертвых, я был настроен скептически. Я знаю, что многие читатели все еще настроены скептически (и я знаю, что некоторые из вас не думают, что мы должны даже писать о них). Но мы видим, что они выжили намного дольше, чем многие стартапы, о которых мы писали.

Главный вопрос сейчас в том, как у них обстоят дела на производстве. Как однажды сказал один известный человек в индустрии электромобилей, «производство — это сложно». И он прав. Наличие отличного дизайна не означает, что компания сможет пережить рост производства.

Рекомендуемое изображение предоставлено Aptera.

Цените оригинальность CleanTechnica и освещение новостей о чистых технологиях? Подумайте о том, чтобы стать участником, сторонником, техническим специалистом или послом CleanTechnica – или покровителем на Patreon.

Не хотите пропустить статью о чистых технологиях? Подпишитесь на ежедневные обновления новостей от CleanTechnica по электронной почте. Или следите за нами в Новостях Google!

У вас есть совет для CleanTechnica, вы хотите разместить рекламу или предложить гостя для нашего подкаста CleanTech Talk? Свяжитесь с нами здесь.

В этой статье:Aptera

Дженнифер Сенсиба — давний любитель автомобилей, писатель и фотограф. Она выросла в магазине трансмиссий и экспериментировала с эффективностью автомобиля с 16 лет, когда водила Pontiac Fiero. Ей нравится исследовать юго-запад США со своим партнером, детьми и животными. Следите за ее последними статьями и другими случайными новостями в Твиттере: https://twitter.com/JenniferSensiba

Gamma-Delta CAR-T Cells Show CAR-Directed and Independent Activity Against Leukemia

. 2020 июль 2;11:1347.

doi: 10.3389/fimmu.2020.01347. Электронная коллекция 2020.

Меир Розенбаум ^{1 2 3} , Амилия Меир ³ , Ярден Ахарони ³ , Орит Ицхаки ² , Джейкоб Шахтер ² , Илан Банк ⁴ , Элад Джейкоби ^{3 5 6} , Михал Дж. Бессер ^{1 2 7}

Принадлежности

• ¹ Кафедра клинической микробиологии и иммунологии, Медицинский факультет им. Саклера, Тель-Авивский университет, Тель-Авив, Израиль.
• ² Институт иммуноонкологии Эллы Лемельбаум, Медицинский центр Шиба, Рамат-Ган, Израиль.
• ³ Центр детской клеточной терапии, Медицинский центр Шиба, Тель-Ха-Шомер, Израиль.
• ⁴ Отделение ревматологии, Медицинский центр Шиба, Тель-Ха-Шомер, Израиль.
• ⁵ Отделение детской гематологии и онкологии, Медицинский центр Шиба, Детская больница Эдмонда и Лили Сафра, Тель ха-Шомер, Израиль.
• ⁶ Кафедра педиатрии, Медицинская школа им. Саклера, Тель-Авивский университет, Тель-Авив, Израиль.
• ⁷ Институт трансляционной медицины Воля, Медицинский центр Шиба, Тель-Авив, Израиль.

• PMID: 32714329
• PMCID: PMC7343910
• DOI: 10.3389/fimmu.2020.01347

Бесплатная статья ЧВК

Меир Розенбаум и соавт. Фронт Иммунол. 2020 .

Бесплатная статья ЧВК

. 2020 июль 2;11:1347.

doi: 10.3389/fimmu.2020.01347. Электронная коллекция 2020.

Авторы

Меир Розенбаум ^{1 2 3} , Амилия Меир ³ , Ярден Ахарони ³ , Орит Ицхаки ² , Джейкоб Шахтер ² , Илан Банк ⁴ , Элад Джейкоби ^{3 5 6} , Михал Дж. Бессер ^{1 2 7}

Принадлежности

• ¹ Кафедра клинической микробиологии и иммунологии, Медицинский факультет им. Саклера, Тель-Авивский университет, Тель-Авив, Израиль.
• ² Институт иммуноонкологии Эллы Лемельбаум, Медицинский центр Шиба, Рамат-Ган, Израиль.
• ³ Центр детской клеточной терапии, Медицинский центр Шиба, Тель-Ха-Шомер, Израиль.
• ⁴ Отделение ревматологии, Медицинский центр Шиба, Тель-Ха-Шомер, Израиль.
• ⁵ Отделение детской гематологии и онкологии, Медицинский центр Шиба, Детская больница Эдмонда и Лили Сафра, Тель ха-Шомер, Израиль.
• ⁶ Кафедра педиатрии, Медицинская школа им. Саклера, Тель-Авивский университет, Тель-Авив, Израиль.
• ⁷ Институт трансляционной медицины Воля, Медицинский центр Шиба, Тель-Авив, Израиль.

• PMID: 32714329
• PMCID: PMC7343910
• DOI: 10.3389/fimmu.2020.01347

Абстрактный

Аутологичные Т-клетки, сконструированные для экспрессии химерного антигенного рецептора (CAR) против CD19антигена находятся на переднем крае современной гематоонкологической терапии, что приводит к высоким показателям ремиссии при В-клеточных злокачественных опухолях. Несмотря на эффективность, основными препятствиями являются сложный и дорогостоящий индивидуальный производственный процесс, а также потеря антигена-мишени CD19 или модуляция, приводящая к резистентности и рецидиву после терапии CAR. Потенциальным решением для этих ограничений является использование донорских γδT-клеток в качестве основы CAR. γδT-клетки не обладают аллогенностью и безопасно используются в гаплоидентичных трансплантатах. Кроме того, известно, что γδT-клетки опосредуют естественные противоопухолевые ответы. Здесь мы описываем 14-дневный процесс продукции, инициированный мононуклеарными клетками периферической крови, что приводит к медианной 185-кратной экспансии γδ Т-клеток высокой чистоты (>98% CD3+ и >99% γδTCR+). Эффективность CAR-трансдукции γδ-Т-клеток была одинаково высокой по сравнению со стандартными CAR-T-клетками (60,5 ± 13,2 и 65,3 ± 18,3% соответственно). CD19-направленные γδCAR-T-клетки были эффективны против CD19+ клеточных линий in vitro и in vivo, демонстрируя продукцию цитокинов, прямое уничтожение мишеней и клиренс лейкемических клеток костного мозга в модели NSG. Множественные инъекции γδCAR-T-клеток и примирование мышей золедронатом приводят к усиленному уменьшению опухоли in vivo . В отличие от стандартных CD19 CAR-T-клеток, γδCAR-T-клетки были способны нацеливаться на CD19-антиген-негативные лейкозные клетки, эффект, который усиливался после примирования клеток золедронатом. В заключение можно сказать, что производство клеток γδCAR-T возможно и приводит к получению высокочистых и эффективных эффекторных клеток. Клетка γδCAR-T может обеспечить многообещающую платформу в аллогенных условиях и может нацеливаться на лейкемические клетки также после потери антигена.

Ключевые слова: В-клеточные злокачественные новообразования; химерный антигенный рецептор; гамма-дельта Т-клетки; иммуноонкология; лейкемия.

Copyright © 2020 Розенбаум, Меир, Ахарони, Ицхаки, Шахтер, Банк, Якоби и Бессер.

Цифры

Рисунок 1

Производство клеток γδCAR-T: (A)…

Рисунок 1

Производство клеток γδCAR-T: (A) Схема производства, показывающая общее увеличение клеток (в крат…

Производство клеток γδCAR-T: (A) Схема получения, показывающая общее размножение клеток (кратное изменение) в соответствии с протоколом. День 0 — сбор крови, выделение РВМС и активация Т-клеток. Каждая линия представляет другого здорового донора. (Б) γδ-Т/αβ-Т-клетки состав донорской крови из CD3-позитивных клеток ( n = 5). (C) CD3-положительные клетки в конечном продукте нетрансдуцированных γδ-T и трансдуцированных γδCAR-T клеток ( н = 6). (D) Чистота клеток γδTCR+ в конечном продукте обоих протоколов ( n = 6). (E) кратное увеличение γδ-T-клеток во время протокола продукции γδCAR-T ( n = 5). (F) Эффективность трансдукции CAR с помощью проточной цитометрии на CD3-положительных клетках, стандартных CAR (sCAR) и γδCAR-T клеточных продуктов ( n = 6). (G) Точечные диаграммы репрезентативного образца, демонстрирующие экспрессию CAR в популяциях γδ и αβ-T-клеток в конечном продукте протоколов sCAR и γδCAR-T-клеток. (H) γδTCR-положительные клетки, гейтированные по CAR-положительным клеткам в конечной композиции sCAR-T-клеток (синие квадраты, n = 6), протокол получения γδCAR-T-клеток (черные кружки, n = 6) и клинически произведенные клетки sCAR-T (красные треугольники, n = 25). Столбцы соответствуют среднему значению, а столбцы погрешностей представляют межквартильный размах.

Рисунок 2

γδCAR-T-клетки демонстрируют CD19цель…

Рисунок 2

γδCAR-T-клетки демонстрируют активность, зависящую от мишени CD19. (A) Уровни IFNγ в среде совместного культивирования…

γδCAR-T-клеток демонстрируют активность, зависящую от мишени CD19. (A) Уровни IFNγ в среде совместного культивирования перечисленных эффекторов с положительными и отрицательными по CD19 клетками-мишенями. (B) Цитотоксическая активность эффекторных клеток в отношении CD19положительные клетки Nalm6 и отрицательные по CD19 клетки CCRF-CEM. Предварительно окрашенные мишени клеточного следа фиолетовым оценивали на связывание аннексина с помощью анализа FACS. Синие столбцы, sCAR; Серые столбцы, γδCAR-T; Белые столбики, γδ-Т-клетки. * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,01, *** P ≤ 0,001, Двухвостый парный T — тест. Столбики погрешностей представляют собой стандартное отклонение.

Рисунок 3

γδCAR-T-клетки проявляют активность против…

Рисунок 3

γδCAR-T-клетки демонстрируют активность против CD19-негативных клонов. (A) Поколение Nalm6 CD19…

γδCAR-T-клетки демонстрируют активность против CD19-негативных клонов. (A) Генерация клеток Nalm6 CD19 KO с помощью CRISPR дает CD10-положительные CD19-отрицательные клетки (Nalm6 ^19neg ). (B,C) Активность клеток γδCAR-T против Nalm6 ^19neg клеток дополнительно усиливается за счет праймирования клеток-мишеней золедронатом. (B) Точечный график, показывающий окрашивание аннексином клеток-мишеней (Nalm6 ^19neg , окрашенных фиолетовым следом клеток), совместно культивируемых с sCAR-T-клетками (вверху) или γδCAR-T-клетками (внизу). (C) Специфическая цитотоксичность различных эффекторов в отношении клеток Nalm6 ^19neg . Клетки γδ-T и γδCAR-T отмечены серыми полосами, клетки sT и sCAR-T отмечены синими полосами. Нетрансдуцированные клетки в неокрашенных кружках и клетки CAR-T в закрашенных кружках. * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,01, Двухвостый парный T — тест. Столбики погрешностей представляют межквартильный диапазон.

Рисунок 4

In vivo активность γδCAR-T…

Рисунок 4

In vivo Активность γδCAR-T-клеток. (A) Лейкемия человека (Nalm6), гейтированная по CD45+…

In vivo Активность γδCAR-T-клеток. (A) Лейкемия человека (Nalm6), гейтированная по CD45+ CD10+ в костном мозге мышей NSG, либо необработанных, либо обработанных нетрансдуцированными γδT-клетками, γδCAR-T или sCAR-T клетками через 14 дней. (B) Лейкемия человека (Nalm6), гейтированная по CD45+ CD10+ в костном мозге мышей NSG, либо не получавших лечения, либо получавших только золедронат (Zol), Zol с клетками γδCART или повторную дозу Zol и γδCAR-T. (C) Персистенция эффекторных клеток человека в.в.в. вводили sCAR-T, γδCAR-T и нетрансдуцированные γδ-T клетки в костный мозг мышей (верхняя панель) и селезенку (нижняя панель) через 3 дня после инъекции. ** P ≤ 0,01, *** P ≤ 0,001, Двухвостый парный T — тест. Столбцы соответствуют среднему значению, а столбцы погрешностей представляют межквартильный размах.

См. это изображение и информацию об авторских правах в PMC

Похожие статьи

• Готовые гамма-дельта Т-клетки Vδ1, сконструированные с использованием специфического глипикан-3 (GPC-3) химерного антигенного рецептора (CAR) и растворимого IL-15, демонстрируют надежную противоопухолевую эффективность в отношении гепатоцеллюлярной карциномы.

  Маккук А., Ян Х.С., Барка Т., Лукас А., Туркоз М., Вонг Дж.Т.С., Нишимото К.П., Бродей М.М., Табризизад М., Гундурао С.Р.Ю., Бай Л., Бхат А., Ан З., Эббот С., Сатпаев Д., Афтаб Б.Т., Герман М. Маккук А. и др. J Иммунный рак. 2021 дек;9(12):e003441. doi: 10.1136/jitc-2021-003441. J Иммунный рак. 2021. PMID: 34916256 Бесплатная статья ЧВК.

• Доклиническая оценка аллогенных CAR Т-клеток, нацеленных на BCMA, для лечения множественной миеломы.

  Соммер С., Болдаджипур Б., Куо Т.К., Бентли Т., Саттон Дж., Чен А., Генг Т., Донг Х., Галетто Р., Валтон Дж., Пертель Т., Джуйлерат А., Гарибольди А., Паскуа Э., Браун С., Чин С.М., Сай Т., Ни И., Дюшато П., Смит Дж., Раджпал А., Ван Бларком Т., Чапарро-Риггерс Дж., Сасу Б.Дж. Соммер С. и др. Мол Тер. 20195 июня; 27(6):1126-1138. doi: 10.1016/j.ymthe.2019.04.001. Epub 2019 8 апр. Мол Тер. 2019. PMID: 31005597 Бесплатная статья ЧВК.

• Тандемный лентивирусный вектор CD19/CD20 CAR управляет направленной и нецелевой антигенной модуляцией в клеточных линиях лейкемии.

  Шнайдер Д., Сюн Ю., Ву Д., Нӧлле В., Шмитц С., Хасо В., Кайзер А., Дропулич Б., Орентас Р.Дж. Шнайдер Д. и соавт. J Иммунный рак. 2017 16 мая; 5:42. doi: 10.1186/s40425-017-0246-1. Электронная коллекция 2017. J Иммунный рак. 2017. PMID: 28515942 Бесплатная статья ЧВК.

• ShRNA-опосредованное подавление PD-1 увеличивает эффективность Т-клеток химерного антигенного рецептора на подкожном простате и ксенотрансплантате лейкемии.

  Чжоу Дж. Э., Ю Дж., Ван Ю, Ван Х, Ван Дж, Ван Ю, Ю Л, Ян З. Чжоу Дж. Э. и др. Биомед Фармаколог. 2021 Май; 137:111339. doi: 10.1016/j.biopha.2021.111339. Epub 2021 4 фев. Биомед Фармаколог. 2021. PMID: 33550044

• Достижения в разработке терапии химерными антигенными рецепторами Т-клеток при остром В-клеточном лимфобластном лейкозе.

  Чжан С., Ли Дж.Дж., Лу П.Х. Чжан X и др. Чин Мед Дж (англ.). 2020 20 февраля; 133 (4): 474-482. дои: 10.1097/CM9.0000000000000638. Чин Мед Дж (англ.). 2020. PMID: 31977556 Бесплатная статья ЧВК. Обзор.

Посмотреть все похожие статьи

Цитируется

• От редакции: Врожденная иммунная клеточная терапия рака.

  Хатвани Н., Роми Р., Пиллаи АБ. Хатвани Н. и др. Фронт Иммунол. 2022 19 августа; 13:1004415. doi: 10.3389/fimmu.2022.1004415. Электронная коллекция 2022. Фронт Иммунол. 2022. PMID: 36059458 Бесплатная статья ЧВК. Аннотация недоступна.

• CAR γδ Т-клетки для иммунотерапии рака. Поле больше желтое, чем зеленое?

  Ганапати Т., Радхакришнан Р., Сакши С., Мартин С. Ганапати Т. и соавт. Рак Иммунол Иммунотер. 2022 г., 12 августа. doi: 10.1007/s00262-022-03260-y. Онлайн перед печатью. Рак Иммунол Иммунотер. 2022. PMID: 35960333 Обзор.

• Новые методы лечения рецидивирующего или рефрактерного острого лимфобластного лейкоза В-клеточной линии у детей: эра точной медицины.

  Мэнсюань С., Фен З., Ранминг Дж. Мэнсюань С. и др. Фронт Педиатр. 2022 23 июня; 10:923419. doi: 10.3389/fped.2022.923419. Электронная коллекция 2022. Фронт Педиатр. 2022. PMID: 35813376 Бесплатная статья ЧВК. Обзор.

• Иммунотерапия рака на основе гамма-дельта-Т-клеток: прошлое-настоящее-будущее.

  Саура-Эстеллер Дж., де Йонг М., Кинг Л.А., Энсинг Э., Виноград Б., де Груйл Т.Д., Паррен PWHI, ван дер Влит Х.Дж. Саура-Эстеллер Дж. и др. Фронт Иммунол. 2022 16 июня; 13:915837. дои: 10.3389/fimmu.2022.915837. Электронная коллекция 2022. Фронт Иммунол. 2022. PMID: 35784326 Бесплатная статья ЧВК. Обзор.

• Аллогенные гамма-дельта Т-клетки как адоптивная клеточная терапия гематологических злокачественных новообразований.

  Джхита Н., Райкар С.С. Джита Н. и др. Изучите Иммунол. 2022;2(3):334-350. doi: 10.37349/ei.2022.00054. Epub 2022 7 июня. Изучите Иммунол. 2022. PMID: 35783107 Бесплатная статья ЧВК.

Просмотреть все статьи «Цитируется по»

использованная литература

1. 1. Джун Ч., Саделайн М. Терапия химерными антигенными рецепторами. N Engl J Med. (2018) 379: 64–73. 10.1056/NEJMra1706169 — DOI — ЧВК — пабмед
2. 1. Джейкоби Э. , Шахани С.А., Шах Н.Н. Обновления по CAR Т-клеточной терапии при В-клеточных злокачественных новообразованиях. Immunol Rev. (2019) 290:39–59. 10.1111/имр.12774 — DOI — пабмед
3. 1. Солтер А.И., Понт М.Дж., Ридделл С.Р. Т-клетки, модифицированные химерным антигенным рецептором: CD19 и дальнейший путь. Кровь. (2018) 131:2621–9. 10.1182/кровь-2018-01-785840 — DOI — ЧВК — пабмед
4. 1. Hamieh M, Dobrin A, Cabriolu A, van der Stegen SJC, Giavridis T, Mansilla-Soto J, et al. . Трогоцитоз и кооперативный лизинг CAR Т-клеток регулируют ускользание опухолевого антигена. Природа. (2019) 568:112–6. 10.1038/с41586-019-1054-1 — DOI — ЧВК — пабмед
5. 1. Шах Н.Н., Фрай Т.Дж. Механизмы резистентности к терапии CAR Т-клетками. Nat Rev Clin Oncol. (2019) 16: 372–85. 10.1038/с41571-019-0184-6 — DOI — пабмед

Типы публикаций

термины MeSH

вещества

клеток Gamma-Delta CAR-T проявляют CAR-направленную и независимую активность против лейкемии

• Список журналов
• Фронт Иммунол
• PMC7343910

Фронт Иммунол. 2020; 11: 1347.

Published online 2020 Jul 2. doi: 10.3389/fimmu.2020.01347

, ^{1, 2, 3} , ³ , ³ , ² , ² , ⁴ , ^{3, 5, 6, *} и ^{1, 2, 7, *}

Информация о доме.

Аутологичные Т-клетки, сконструированные для экспрессии химерного антигенного рецептора (CAR) против антигена CD19, находятся на переднем крае современной онкогематотерапии, что приводит к высоким показателям ремиссии при В-клеточных злокачественных опухолях. Несмотря на эффективность, основные препятствия связаны со сложным и дорогостоящим индивидуальным производственным процессом и CD19.потеря антигена-мишени или модуляция, приводящая к резистентности и рецидиву после терапии CAR. Потенциальным решением для этих ограничений является использование донорских γδT-клеток в качестве основы CAR. γδT-клетки не обладают аллогенностью и безопасно используются в гаплоидентичных трансплантатах. Кроме того, известно, что γδT-клетки опосредуют естественные противоопухолевые ответы. Здесь мы описываем 14-дневный процесс продукции, инициированный мононуклеарными клетками периферической крови, что приводит к медианной 185-кратной экспансии γδ Т-клеток высокой чистоты (>98% CD3+ и >99% γδTCR+). Эффективность CAR-трансдукции γδ-Т-клеток была одинаково высокой по сравнению со стандартными CAR-T-клетками (60,5 ± 13,2 и 65,3 ± 18,3% соответственно). CD19-направленные γδCAR-T-клетки были эффективны против CD19+ клеточных линий in vitro и in vivo, демонстрируя продукцию цитокинов, прямое уничтожение мишеней и клиренс лейкемических клеток костного мозга в модели NSG. Множественные инъекции γδCAR-T-клеток и примирование мышей золедронатом приводят к усиленному уменьшению опухоли in vivo . В отличие от стандартных CD19 CAR-T-клеток, γδCAR-T-клетки были способны нацеливаться на CD19-антиген-негативные лейкозные клетки, эффект, который усиливался после примирования клеток золедронатом. В заключение можно сказать, что производство клеток γδCAR-T возможно и приводит к получению высокочистых и эффективных эффекторных клеток. Клетка γδCAR-T может обеспечить многообещающую платформу в аллогенных условиях и может нацеливаться на лейкемические клетки также после потери антигена.

Ключевые слова: гамма-дельта Т-клетки, химерный антигенный рецептор, лейкемия, иммуноонкология, В-клеточные злокачественные новообразования

Трансдукция Т-клеток химерным антигенным рецептором (CAR) позволяет нацеливаться на внеклеточные домены, что приводит к CAR-индуцированной Т-клеточной цитотоксичности и продукции цитокинов независимым от MHC образом (1). Аутологичные CAR-T-клетки, направленные против пан-В-клеточного антигена CD19, были одобрены для лечения острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ) и неходжкинской лимфомы (НХЛ) после того, как они показали высокие показатели ремиссии у пациентов, ранее получавших интенсивное лечение, которые у некоторых могут быть длительными. (2, 3). Тем не менее, многие пациенты не реагируют на CAR-T-клетки или испытывают рецидив из-за ряда механизмов, включая потерю перенесенных Т-клеток у некоторых пациентов и изменения экспрессии или плотности антигена-мишени у других (4, 5). Таким образом, были предложены дополнительные подходы с множественным нацеливанием, обычно с использованием двойных CAR (5, 6), но также была показана последовательная потеря антигена после множественного нацеливания, опосредованного CAR (7, 8). Кроме того, эти клеточные терапии по-прежнему являются аутологичными продуктами, что требует сложного и индивидуального производства, связанного со значительным финансовым бременем.

Лимфоциты, несущие γδT-клеточный рецептор (γδT), представляют собой небольшое подмножество цитотоксических Т-клеток периферической крови, которым не требуется антигенная презентация молекул MHC для распознавания и функционирования (9, 10). In vitro и in vivo размножение этих клеток возможно, особенно при воздействии на них аминобисфосфонатов, таких как золедронат (11, 12). Известно, что γδT-клетки функционируют через барьеры MHC и не вызывают реакции «трансплантат против хозяина» (13). Более того, противоопухолевая активность была продемонстрирована с использованием расширенного Vγ9.Т-клетки Vδ2 в доклинических исследованиях и ранних фазах клинических испытаний (14), хотя эффекты против ОЛЛ и НХЛ остаются в лучшем случае скромными (13, 15, 16).

Поскольку γδT-клетки можно безопасно применять в аллогенных условиях и они проявляют естественную противоопухолевую реактивность, оснащение γδT-клеток CAR может предоставить способ безопасного использования аллогенных CAR и потенциально может быть нацелено на минорные клоны с более низкой плотностью антигена, которые могут не быть устранены стандартными Т-клетками CAR. Здесь мы сообщаем о нашем протоколе использования γδ Т-лимфоцитов в качестве платформы для CAR-T-клеток. Мы показываем, что клетки γδCAR-T эффективны против CD19.злокачественных новообразований in vitro и in vivo и обладают активностью против лейкозных клонов, лишенных экспрессии CD19.

Этика

Материал пациента был получен в рамках клинического исследования, о котором сообщалось ранее ({«type»:»clinical-trial»,»attrs»:{«text»:»NCT02772198″,»term_id»:»NCT02772198″} }NCT02772198) (17, 18) и одобрен IRB Медицинского центра Шиба и Министерством здравоохранения Израиля. Все эксперименты на животных были одобрены комитетами по процессу институциональной этической проверки и проводились с одобрения израильского институционального комитета по уходу и использованию животных (1131/17/ANIM).

Культура клеток

Линии клеток лейкемии Nalm6, CCRF-CEM, Toledo и K562 были любезно предоставлены Стивом Фельдманом и выращены в стандартных условиях культивирования с использованием среды RPMI с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), 2 мМ л -Глутамат, пируват натрия, буфер Hepes 0,1 М (все от Biological Industries), 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (Sigma-Aldrich) («среда для клеток-мишеней»). Для активации и трансдукции Т-клетки культивировали в RPMI с добавлением 10% FBS, 2 мМ L-Glu, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина и интерлейкина-2 (ИЛ-2, 100 МЕ/мл, Novartis). пролейкин) («Т-клеточная среда»). 29Клетки 3T, используемые для продукции вируса, культивировали в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы, дополненной 10% FBS, 2 мМ L-глутамата, пирувата натрия, буфером Hepes 0,1 М и раствором заменимых аминокислот (все от Biological Industries). В качестве альтернативы среда может быть дополнена человеческой сывороткой AB вместо FBS.

CAR-T Cell Production

Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) выделяли с помощью центрифугирования в градиентах плотности LymphoprepTM (технологии Alere) и активировали в среде Т-клеток с 100 МЕ/мл IL2 и либо с OKT3 50 нг/мл ( Invitrogen) для стандартной экспансии Т-клеток (опубликовано ранее) (17) или золедроновая кислота 2,94 мкМ (Novartis) для размножения γδT-клеток. На 5-й день культивирования активированные клетки трансдуцировали ретровирусом CD19 CAR на основе остова MSGV, трансдуцированного плазмидой FMC63-CD28-CD3zeta, любезно предоставленной Стивом Фельдманом. Для этой цели 6-луночные планшеты (Falcon), обработанные нетканевой культурой, предварительно покрывали 20 мкг ретронектина на лунку (10 мкг/мл, Takara-Clontech) в течение 3 дней при 4°C с последующей 20-минутной инкубацией. с 2,5% раствором BSA (Caisson labs, BSA фракция V) в PBS (Biological Industries) и однократной промывкой PBS. Планшеты загружали 4 мл вируса, разбавленного 1:1 Т-клеточной средой на лунку, и центрифугировали при 2000 g в течение 2 ч при 32°C. После центрифугирования супернатант собирали, оставляя только 1 мл на лунку. Затем планшеты засевали РВМС, активированными ОКТ-3 или золедроновой кислотой, в количестве от 2 до 2,5 × 106 клеток/лунку, центрифугировали при 1000 g в течение 20 мин при 32°C и инкубировали в течение ночи при 37°C. Нетрансдуцированные γδТ-клетки и стандартные Т-клетки обрабатывали одинаково, только без добавления вируса, и они служили в качестве отрицательного контроля. День 9Клетки γδT и γδCAR-T подверглись истощению клеток αβTCR+ с использованием магнитных колонок для истощения MACS LD, блокирующего реагента FcR, анти-TCRa/b-биотина и анти-биотиновых микрошариков (все от Miltenyi). Оставшиеся γδT-клетки и стандартные CAR-T-клетки дополнительно размножали в среде, содержащей IL-2 для Т-клеток, до 13–15 дней.

Стандартные CAR Т-клетки для клинических условий были получены так же, как стандартные CAR T, описанные здесь, с той лишь разницей, что для клинического производства CAR T используется 300 МЕ/мл IL-2 (вместо 100 МЕ/мл), трансдукция проводят на 2-й день (вместо 5-го дня), и в культуральную среду добавляют сыворотку человека AB (вместо FBS) (17).

Совместное культивирование, уровни цитокинов и цитотоксические анализы

Совместное культивирование проводили в 96-луночных планшетах с плоским дном. Для тестов на секрецию IFN-γ Т-клетки и мишени высевали по 100000 клеток/лунку в течение ночи в среду для клеток-мишеней. ELISA для обнаружения человеческого IFN-γ проводили с использованием набора Elisa MAX™ Deluxe компании Biolegend. Для цитотоксических анализов мишени окрашивали CellTrace™ Violet в соответствии с инструкциями производителя и высевали 40 000 клеток на лунку. Затем добавляли Т-клетки в концентрации 160000 клеток/мл. Через 2,5–3 ч при 37°C клетки собирали из лунок и окрашивали на апоптоз реагентом Annexin V-Cy5 (Biovision). CellTrace-положительные клетки оценивали на окрашивание аннексином V с помощью проточной цитометрии.

Проточная цитометрия

Проточная цитометрия была выполнена на Beckman Coulter’s Gallios. Для обнаружения рецептора CD19 CAR мы использовали биотинилированные антимышиные FAB в качестве первичного антитела (Jackson), мышиный гамма-глобулин в качестве блокирующего реагента (Jackson) и анти-биотин-виогрин в качестве вторичного антитела (Miltenyi). Для дополнительного окрашивания использовали следующие антитела: античеловеческий CD3-FITC, античеловеческий TCRa/b-APC, античеловеческий TCRg/d-PE, античеловеческий CD19-PE, античеловеческий CD10-PE-Cy7, античеловеческий CD45 viogreen, Анти-мышиный CD45 APC и краситель Ghost Red 780 Viability Dye для исключения мертвых клеток (все от Miltenyi). Все антитела инкубировали с образцами в течение 20 мин при 4°С. Анализ был выполнен с использованием программного обеспечения для анализа FlowJo V10.

Nalm6 CRISPR CD19 KO

Мы создали вирус Ленти, экспрессирующий CAS9, и sgRNA, нацеленную на CD19. Последовательность sgRNA 5′-TGGAATGTTTCGGACCTAGGTGG-3′ (19) была клонирована в pL-CRISPR.EFS.GFP (адген Plasmid # 57818 — Lentiviral CRISPR-Cas9 доставка для SpCas9 и sgRNA. Ко-экспрессирует eGFP через сайт расщепления P2A). Оболочечная плазмида представляла собой pMD2.G (адгенная плазмида № 12259) и упаковочная плазмида psPAX2 (аддгенная плазмида № 12260). Плазмиды трансфицировали в клеточную линию 293Т с использованием системы трансфекции млекопитающих с фосфатом кальция (Promega cat#E1200). Вирусный супернатант использовали для инфицирования клеток Nalm6 с добавлением полибрена (8 нг/мл). CD19положительные клетки были истощены с использованием конъюгированного с РЕ антитела против CD19 и магнитных шариков против РЕ на колонке для истощения MACS LD (Miltenyi) с последующим культивированием отдельных клеток путем посева. CD19-отрицательные одиночные клоны подтверждали с помощью проточной цитометрии, и лунки секвенировали для локуса CD19 KO.

Животные и

Для всех экспериментов in vivo использовались самки мышей NOD-SCID-IL-2Rγ- (NSG) в возрасте 8–15 недель, приобретенные в лабораториях Джексона. Мышам вводили в хвостовую вену 1 × 10 ⁶ Клетки Nalm6 для инокуляции лейкемии с последующими внутривенными (в/в) инъекциями эффекторных клеток с внутрибрюшинными (в/б) инъекциями или без них (20).

Статистический анализ

Все статистические анализы проводились с использованием Prism v8 (программное обеспечение GraphPad). Статистические сравнения между двумя группами определяли с помощью двустороннего параметрического или непараметрического (тест Манна-Уитни U ) t -критерия для непарных данных или двустороннего парного критерия Стьюдента t — тесты для подобранных образцов (полученных от одного и того же донора). P < 0,05 считались статистически значимыми.

Генерация человеческих CD19 CAR, экспрессирующих γδT-клетки, из периферической крови

Сначала мы разработали и откалибровали протокол для генерации γδT-клеток, экспрессирующих CD19 CAR, и истощения αβ-TCR+ клеток (). В среднем γδT-клетки состояли из 3,4% (± 0,73%) CD3-позитивных клеток в исходном исходном материале РВМС (). Активация золедронатом в день 0 приводила к специфической пролиферации γδT-клеток, в то время как общее количество клеток оставалось одинаковым. На 5-й день клетки трансдуцировали CD19.CAR с последующим истощением αβTCR+ на 9-й день и дальнейшей пролиферацией γδCAR-T в течение 13–15 дней. Нетрансдуцированные γδT-клетки служили контролем. Конечные продукты трансдуцированных и нетрансдуцированных γδT-клеток содержали 98% (±1,77%) и 98,1% (±1,49%) CD3-положительных клеток, соответственно, с высокой чистотой γδT-клеток, что составляет 99,5% (±0,5% ) клеток CD3+ ( n = 6, ). Среднее кратное изменение γδT-клеток составило 185 (диапазон 29–1376) для трансдуцированных клеток по сравнению со средним значением 363 (диапазон 81–2350) для нетрансдуцированных γδT-клеток с переменным диапазоном между разными донорами (, p = 0,2 парных T -тест). В качестве контроля мы параллельно запускали стандартную продукцию CAR-T-клеток (sCAR-T) для каждого донора, используя протокол, как и для клинических условий (17), только в меньшем масштабе, и трансдукцию проводили на 5-й день вместо 2-го. Эффективность трансдукции CAR варьировала от 40 до 80% () и не отличалась между sCAR-T и γδCAR-T (60,5% ± 13,2 и 65,3% ± 18,3 соответственно). Репрезентативный точечный график FACS представлен на . Следует отметить, что продукт sCAR-T-клеток также содержал γδT-клетки и γδCAR-T-клетки (). Мы проанализировали 25 инфузионных продуктов, вводимых пациентам с лейкемией и лимфомой, включенных в клиническое испытание, на экспрессию γδTCR. Конечные продукты имели в среднем 1,15% γδT и 0,77% γδCAR-T (). Процент γδCAR-T в конечном продукте не был связан с ответом (17). Подводя итог, с помощью этого протокола мы можем получить чистую фракцию γδT-клеток, лишенных αβ T-клеток, с высокой экспрессией CD19.CAR, и это в течение 2 недель.

Открыть в отдельном окне

Получение клеток γδCAR-T: (A) Схема получения, показывающая общее размножение клеток (с кратным изменением) по протоколу. День 0 — сбор крови, выделение РВМС и активация Т-клеток. Каждая линия представляет другого здорового донора. (Б) γδ-Т/αβ-Т-клетки состав донорской крови из CD3-позитивных клеток ( n = 5). (C) CD3-положительные клетки в конечном продукте нетрансдуцированных γδ-T и трансдуцированных γδCAR-T клеток ( н = 6). (D) Чистота клеток γδTCR+ в конечном продукте обоих протоколов ( n = 6). (E) кратное увеличение γδ-T-клеток во время протокола продукции γδCAR-T ( n = 5). (F) Эффективность трансдукции CAR с помощью проточной цитометрии на CD3-положительных клетках, стандартных CAR (sCAR) и продуктах клеток γδCAR-T ( n = 6). (G) Точечные диаграммы репрезентативного образца, демонстрирующие экспрессию CAR в популяциях γδ и αβ-T-клеток в конечном продукте протоколов sCAR и γδCAR-T-клеток. (H) γδTCR-положительные клетки, гейтированные по CAR-положительным клеткам в конечной композиции sCAR-T-клеток (синие квадраты, n = 6), протокол получения γδCAR-T-клеток (черные кружки, n = 6) и клинически произведенные клетки sCAR-T (красные треугольники, n = 25). Столбцы соответствуют среднему значению, а столбцы погрешностей представляют межквартильный размах.

Клетки γδCAR-T демонстрируют CD19-зависимую активность в отношении линий опухолевых клеток

Для проверки эффективности клеток γδCAR-T по сравнению с клетками sCAR-T in vitro , были проведены анализы совместного культивирования CD19-положительных и отрицательных клеточных линий. Нетрансдуцированные активированные γδT-клетки, γδCAR-T-клетки и sCAR-T-клетки совместно инкубировали с клеточной линией B-ALL Nalm6, клеточной линией B-NHL Toledo и с K562, трансдуцированным для экспрессии CD19 (K562-CD19) . Антиген-отрицательные контроли представляли собой клеточную линию T-ALL CCRF-CEM и клеточную линию K562-NGFR. Тестирование секреции IFNγ после инкубации в течение ночи при соотношении Т-клетки/мишень 1:1 показало, что γδCAR-T-клетки обладают высокой реактивностью против CD19.экспрессирующие опухолевые клетки (). Клетки γδCAR-T и sCAR-T демонстрировали значительно более высокие уровни CD19-зависимой секреции IFNγ по сравнению с нетрансдуцированным γδT (γδCAR-T по сравнению с γδT, p = 0,005, p = 0,01 и p = 0,001; sCAR-T по сравнению с γδT, p <0,001, p <0,001 и p = 0,001 для NALM6, Toledo и K562-CD19 соответственно). Уровень IFNγ в супернатанте сокультуры с γδCAR-T-клетками был ниже, чем измеренный в сокультуре с sCAR-T-клетками в случае клеточных линий Nalm6 и Toledo (9).0051 p = 0,007 и p = 0,02 соответственно), но не с искусственно экспрессирующей клеточной линией K562-CD19 ( p = 0,08, ).

Открыть в отдельном окне

γδCAR-T-клетки демонстрируют активность, зависящую от мишени CD19. (A) Уровни IFNγ в среде совместного культивирования перечисленных эффекторов с положительными и отрицательными по CD19 клетками-мишенями. (B) Цитотоксическая активность эффекторных клеток в отношении CD19-положительных клеток Nalm6 и CD19-отрицательных клеток CCRF-CEM. Предварительно окрашенные мишени клеточного следа фиолетовым оценивали на связывание аннексина с помощью анализа FACS. Синие столбцы, sCAR; Серые столбцы, γδCAR-T; Белые столбики, γδ-Т-клетки. * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,01, *** P ≤ 0,001, Двухвостый парный T — тест. Столбики погрешностей представляют собой стандартное отклонение.

Для проверки цитотоксической активности мишени оценивали на окрашивание аннексином после совместного культивирования в течение 2,5 часов при соотношении Т-клетки/мишень 5:1. Клетки γδCAR-T и sCAR-T демонстрируют повышенную цитотоксическую активность в отношении CD19-положительных Nalm6, что приводит к экспрессии аннексина на 92% (±2,8%) и 93% (±1,8%) на мишенях по сравнению с активированными γδT-клетками (29).± 13,8%, n = 3, p < 0,001). Никакой разницы в экспрессии аннексина CD19-негативных мишеней не наблюдалось ().

Клетки γδCAR-T показывают усиление

Основным препятствием для терапии CAR-T является потеря антигена-мишени в результате различных механизмов. Известно, что γδT-клетки проявляют антилейкемическую активность, особенно после обработки золедронатом (13). Таким образом, мы предположили, что использование неспецифических механизмов может привести к цитотоксичности также в отношении CD19. -отрицательные цели. Для дальнейшего изучения этого открытия мы создали клеточную линию B-ALL с нокаутом CD19 Nalm6. γδCAR-T, γδT, sCAR-T и нетрансдуцированные активированные Т-клетки совместно культивировали с Nalm6 ^19neg в течение 3 ч при соотношении Т-клетки: мишень 4:1. Как γδT-клетки, так и γδCAR-T-клетки продемонстрировали повышенную цитотоксичность в отношении клеток Nalm6 ^19neg по сравнению со стандартными Т-клетками или sCAR-T-клетками (, p <0,001 для всех сравнений γδT или γδCAR-T с нетрансдуцированными T или СКАР-Т). Примирование золедронатом еще больше усилило этот эффект, что привело к более высокой экспрессии целевого аннексина Nalm6 ^19neg клеток инкубировали с γδT (57% после праймирования против 41% без золедроната, p = 0,007), а также с γδCAR-T (55% после праймирования против 42% без золедроната, p = 0,02, ) , избегая потенциального эффекта, который может быть нацелен на второстепенные CD19-негативные клоны.

Открыть в отдельном окне

γδCAR-T-клетки демонстрируют активность против CD19-негативных клонов. (A) Генерация клеток Nalm6 CD19 KO с помощью CRISPR дает CD10-положительные CD19-отрицательные клетки (Nalm6 ^19отриц ). (B,C) Активность клеток γδCAR-T против клеток Nalm6 ^19neg дополнительно усиливается за счет примирования клеток-мишеней золедронатом. (B) Точечный график, показывающий окрашивание аннексином клеток-мишеней (Nalm6 ^19neg , окрашенных фиолетовым следом клеток), совместно культивируемых со sCAR-T-клетками (вверху) или γδCAR-T-клетками (внизу). (C) Специфическая цитотоксичность различных эффекторов в отношении клеток Nalm6 ^19neg . Клетки γδ-T и γδCAR-T отмечены серыми полосами, клетки sT и sCAR-T отмечены синими полосами. Нетрансдуцированные клетки в неокрашенных кружках и клетки CAR-T в закрашенных кружках. * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,01, Двухвостый парный T -тест. Столбики погрешностей представляют межквартильный диапазон.

Клетки γδCAR-T Проявляют активность

на 2-й день с 4 × 10 ⁶ γδCAR-T-клеток, sCAR-T или γδT-клеток на мышь. Эффективность трансдукции CAR составила 75–85% во всех экспериментах. Нелеченые мыши с лейкемией служили контролем. Через две недели после инъекции эффекторных клеток мышей умерщвляли для оценки лейкемического поражения костного мозга. Лейкемическая нагрузка в костном мозге мышей, не получавших лечения, и мышей, получавших γδT-клетки, была значительной (в среднем 62 и 55% клеток костного мозга соответственно). Присутствие нетрансдуцированных γδT-клеток человека не приводило к значительному снижению лейкемии в этой модели (9).0051 p = 0,89, Манн-Уитни). Лечение клетками γδCAR-T или sCAR-T приводит к резкому снижению лейкемической нагрузки в костном мозге мышей-реципиентов (до 5 и 0,1% соответственно, p <0,001 по сравнению с мышами, не получавшими лечения, или мышами, получавшими γδT-клетки). ), демонстрируя in vivo активность γδCAR-T-клеток (). Тем не менее, было отмечено, что следы лейкемии были выше у реципиентов γδCAR-T-клеток по сравнению с мышами, получавшими sCAR-T. В целях дальнейшего улучшения in vivo противоопухолевая реактивность Т-клеток γδCAR, мышей обрабатывали золедронатом, который, как известно, является первичной мишенью для γδT-клеток, и вводили вторую дозу γδCAR-T-клеток, оба ранее показали улучшение противоопухолевого эффекта -трансдуцированные γδT-клетки (21). Внутрибрюшинная инъекция золедроната (1,0 мкг/г) мышам-носителям лейкемии в дни -1, 2, 6, 8 и 10 по-прежнему приводила к медиане 3% оставшихся лейкозных клеток в костном мозге (2). Однако добавление второй дозы γδCAR-T-клеток на 7-й день, 3 × 10 ⁶ Т-клеток на мышь в дополнение к режиму введения золедроната приводят к дальнейшему снижению нагрузки Nalm6 в костном мозге почти до 1% ( p = 0,06, ).

Открыть в отдельном окне

In vivo Активность γδCAR-T-клеток. (A) Лейкемия человека (Nalm6), гейтированная по CD45+ CD10+ в костном мозге мышей NSG, не получавших лечение или получавших нетрансдуцированные γδT-клетки, γδCAR-T или sCAR-T клетки, через 14 дней. (B) Лейкемия человека (Nalm6), гейтированная по CD45+ CD10+ в костном мозге мышей NSG, либо не получавших лечения, либо получавших только золедронат (Zol), Zol с клетками γδCART или повторную дозу Zol и γδCAR-T. (C) Персистенция эффекторных клеток человека в.в.в. вводили sCAR-T, γδCAR-T и нетрансдуцированные γδ-T клетки в костный мозг мышей (верхняя панель) и селезенку (нижняя панель) через 3 дня после инъекции. ** P ≤ 0,01, *** P ≤ 0,001, Двухвостый парный T — тест. Столбцы соответствуют среднему значению, а столбцы погрешностей представляют межквартильный размах.

Поскольку ранняя потеря эффекторных Т-клеток может быть связана с мишенеположительным рецидивом, мы затем проверили персистенцию введенных эффекторных клеток у мышей. Клетки γδT, γδCAR-T и sCAR-T, окрашенные фиолетовым цветом (5 × 10 ⁶ на мышь) вводили мышам с лейкемией. Через 3 дня собирали костный мозг и селезенку и тестировали на наличие положительных по красителю клеток (1). Меньшее количество эффекторных Т-клеток человека было обнаружено как в селезенке, так и в костном мозге мышей-реципиентов γδCAR-T и γδT-клеток по сравнению с реципиентами sCAR-T-клеток ( p <0,001 для обоих сравнений в костном мозге и p < 0,01 для обоих сравнений в селезенке). Таким образом, в модели NSG мы отметили хорошую противолейкемическую активность, но ограниченную персистенцию γδCAR-T-клеток.

В этой работе мы продемонстрировали способность эффективно трансдуцировать и размножать γδT-клетки с помощью CAR, нацеленного на CD19. γδCAR-T были эффективны против линий опухолевых клеток CD19+, как in vivo , так и in vitro . Более того, мы могли видеть эффект против клонов CD19, который не зависел от CAR.

Отсутствие аллогенности и возможность использования третьей стороной делают клетки γδ отличными кандидатами в качестве основы CAR-T-клеток. Ранее сообщалось о попытках трансдукции γδT-клеток с помощью CAR посредством экспансии CAR 1-го поколения на основе золедроната (15) или пролиферации поликлональных γδT-клеток, трансдуцированных CD19.на антигенпрезентирующие клетки (22). Оба метода включают процесс отбора для обеспечения чистоты γδT-клеток, аналогично нашему протоколу. Следует отметить, что оба метода показали эффективность in vitro против мишени CAR, но это не сравнивалось со стандартными CAR-T-клетками, что в настоящее время имеет важное значение для коммерчески доступных CAR-T-клеток. Мы провели прямое сравнение γδCAR-T и sCAR-T, показав сопоставимую эффективность трансдукции и цитотоксичность in vitro в отношении CD19.положительные мишени и эффект in vivo , который был глубоким, но уступал эффекту sCAR-T. Мы также продемонстрировали присутствие клеток γδCAR-T в клинических продуктах, хотя и в низком процентном соотношении. Группа Sadelain ранее продемонстрировала сравнимую активность γδCAR-T и sCAR-T in vitro и in vivo в отношении внутрибрюшинной модели опухоли Raji (23). Известно, что Raji, клеточная линия Burkitt-NHL, экспрессирует костимулирующие молекулы (24), которые, возможно, помогали in vivo , убиваемый клетками γδCAR-T. Подобно другим (22), мы также не смогли продемонстрировать полное удаление агрессивной клеточной линии Nalm6 ALL в мышиных моделях, обработанных клетками γδCAR-T, что может быть объяснено ограниченной персистенцией клеток γδCAR-T по сравнению с клетками sCAR-T. клетки. Действительно, повторная инфузия γδCAR-T улучшала антилейкемические результаты. Потеря γδCAR-T может быть результатом нескольких факторов, в том числе отсутствия поддерживающей микросреды для этих клеток у мышей с подавленным иммунитетом, что может быть улучшено с помощью добавок цитокинов, таких как IL-2 (25). Другой возможный вклад может быть связан с повышенной индуцированной активацией гибелью клеток (AICD), которая, как известно, происходит с активированными γδT-клетками. Эти задачи должны быть решены в дальнейшей работе.

Потеря CD19 представляет собой серьезную проблему у пациентов с рецидивом с персистирующими CAR-T-клетками или у пациентов, ранее получавших терапию, направленную на CD19 (26). Текущие модели использования двух (или более) CAR, трансдуцированных на одну клетку (различными методами) (27), показывают некоторый успех в доклинических моделях, но клинические результаты еще не созрели. Кроме того, у пациентов с НХЛ или ОЛЛ была показана последовательная потеря антигена. Использование естественного не-MHC ограниченного нацеливания, необязательного с помощью γδT-клеток, показало антилейкемическую активность, которая может быть усилена после введения золедроната (13). Мы показали, что этот эффект сохраняется после CAR-трансдукции γδT-клеток и не зависит от активации CAR его лигандом, как показано путем нацеливания на антиген-негативные клетки. Таким образом, использование этого неспецифического механизма нацеливания, независимого от MHC, помимо специфичности CAR, может предотвратить потерю антигена и последующий рецидив и требует дальнейшего изучения.

В заключение мы разработали быстрый и надежный протокол для производства γδCAR-T-клеток. Эти клетки продемонстрировали противоопухолевую активность in vitro и in vivo . Клетка γδCAR-T может обеспечить многообещающую платформу в аллогенных условиях и может нацеливаться на антиген-негативные клоны. Дальнейшие задачи, в том числе улучшение стойкости in vivo , должны быть решены до клинического применения. Уравнения должны быть вставлены в редактируемом формате из редактора уравнений.

Необработанные данные, подтверждающие выводы этой статьи, будут предоставлены авторами без неоправданных оговорок.

Исследование на животных было рассмотрено и одобрено институциональным комитетом по этической экспертизе.

MR, EJ, IB и MB внесли свой вклад в концепцию и дизайн исследования. MR, AM, YA и OI провели эксперименты и получили данные. MR написал первый черновик рукописи. EJ, IB, JS и MB критически пересмотрели его для важного интеллектуального контента. Все авторы внесли свой вклад в доработку рукописи, прочитали и одобрили представленную версию.

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Мы хотели бы поблагодарить профессора Шая Израэли и сотрудников его лаборатории, доктора Ниру Блум и доктора Викторию Марку-Малину за техническую помощь и плодотворные обсуждения, а также г-жу Дайану Бар за помощь с образцами пациентов и добровольцев.

Финансирование. Эта работа финансировалась Исследовательским центром гематологических злокачественных новообразований Дотан, Тель-Авивский университет, Израиль.

1. June CH, Sadelain M. Терапия химерными антигенными рецепторами. N Engl J Med. (2018) 379: 64–73. 10.1056/NEJMra1706169 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

2. Jacoby E, Shahani SA, Shah NN. Обновления по CAR Т-клеточной терапии при В-клеточных злокачественных новообразованиях. Immunol Rev. (2019) 290:39–59. 10.1111/imr.12774 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

3. Salter AI, Pont MJ, Riddell SR. Т-клетки, модифицированные химерным антигенным рецептором: CD19 и дальнейший путь. Кровь. (2018) 131: 2621–9. 10.1182/blood-2018-01-785840 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

4. Hamieh M, Dobrin A, Cabriolu A, van der Stegen SJC, Giavridis T, Mansilla-Soto J, и др. Трогоцитоз CAR Т-клеток и кооперативный лизинг регулируют ускользание опухолевого антигена. Природа. (2019) 568:112–6. 10.1038/s41586-019-1054-1 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

5. Shah NN, Fry TJ. Механизмы резистентности к терапии CAR Т-клетками. Nat Rev Clin Oncol. (2019) 16: 372–85. 10.1038/с41571-019-0184-6 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

6. Perna F, Berman SH, Soni RK, Hendrickson RC, Brennan CW, Sadelain M. Объединение протеомики и транскриптомики для систематического комбинаторного химерного антигена Рецепторная терапия ОМЛ, статья, объединяющая протеомику и транскриптомику для систематической комбинаторной терапии химерным антигенным рецептором ОМЛ. Раковая клетка. (2017) 32: 506–19.e5. 10.1016/j.ccell.2017.09.004 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

7. Hegde M, Mukherjee M, Grada Z, Pignata A, Landi D, Navai SA, et al. Тандемные Т-клетки CAR, нацеленные на HER2 и IL13R α 2, уменьшают утечку опухолевого антигена. Джей Клин Инвест. (2016) 126:3036–52. 10.1172/JCI83416 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

8. Shalabi H, Kraft IL, Wang HW, Yuan CM, Yates B, Delbrook C, et al.. Последовательная потеря антигенов поверхности опухоли после терапии Т-клетками с химерными антигенными рецепторами при диффузной В-крупноклеточной лимфоме. Гематология. (2018) 103:e215–8. 10.3324/гематол.2017.183459[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

9. Legut M, Cole DK, Sewell AK. Перспективы Т-клеток γ δ и рецептора Т-клеток γ δ для иммунотерапии рака. Селл Мол Иммунол. (2015) 12:656–68. 10.1038/cmi.2015.28 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

10. Сильва-Сантос Б., Серр К., Норелл Х. γ δ Т-клетки при раке. Нат Рев Иммунол. (2015) 15:683–91. 10.1038/nri3904 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

11. Fournié JJ, Sicard H, Poupot M, Bezombes C, Blanc A, Romagné F и др.. Какие уроки можно извлечь из испытаний иммунотерапии рака на основе γ δ Т-клеток? Селл Мол Иммунол. (2013) 10:35–41. 10.1038/cmi.2012.39 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

12. Марку-Малина В., Гарелик Д., Пешес-Елоз Н., Воль А., Зак Л., Нагар М. и др.. Полученные из периферической крови клеточные линии, обогащенные γ9δ2 t-клетками, от пациентов с мультиформной глиобластомой оказывают противоопухолевое действие in vitro . Агенты J Biol Regul Homeost. (2016) 30:17–30. [PubMed] [Google Scholar]

13. Airoldi I, Bertaina A, Prigione I, Zorzoli A, Pagliara D, Cocco C, et al. γ δ Восстановление Т-клеток после HLA-гаплоидентичной гемопоэтической трансплантации, лишенной TCR-α β +/CD19+ лимфоцитов. Кровь. (2015) 125:2349–58. 10.1182/blood-2014-09-599423 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

14. Deniger DC, Moyes JS, Cooper LJN. Клинические применения гамма-дельтаТ-клеток с мультивалентным иммунитетом. Фронт Иммунол. (2014) 5:636. 10.3389/fimmu.2014.00636 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

15. Rischer M, Pscherer S, Duwe S, Vormoor J, Rossig C. Человеческие γ δ Т-клетки как медиаторы химерных рецептор перенаправляет противоопухолевый иммунитет. Бр Дж Гематол. (2004) 126:583–92. 10.1111/j.1365-2141.2004.05077.x [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

16. Wilhelm M, Kunzmann V, Eckstein S, Reimer P, Weissinger F, Ruediger T, et al.. γ δ Т-клетки для иммунотерапии больных лимфоидными злокачественными новообразованиями. Кровь. (2003) 102:200–6. 10.1182/blood-2002-12-3665 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

17. Itzhaki O, Jacoby E, Nissani A, Levi M, Nagler A, Kubi A, et al. Прямое сравнение CD19 CAR-T-клеток собственного производства у пациентов с ОЛЛ и НХЛ. J Иммунный рак. (2020) 8:e000148. 10.1136/jitc-2019-000148 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

18. Jacoby E, Bielorai B, Avigdor A, Itzhaki O, Hutt D, Nussboim V, et al. Локально продуцируемые Т-клетки CD19 CAR приводят к клиническим ремиссиям при медуллярном и экстрамедуллярном рецидивирующем остром лимфобластном лейкозе. Am J Гематол. (2018) 93: 1485–92. 10.1002/ajh.25274 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

19. Walker AJ, Majzner RG, Zhang L, Wanhainen KM, Long AH, Nguyen SM, et al. Плотность опухолевого антигена и рецептора регулирует эффективность химерный антигенный рецептор, нацеленный на киназу анапластической лимфомы. Мол Тер. (2017) 25:2189–201. 10.1016/j.ymthe.2017.06.008 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

20. Zhao D, Wu J, Zhao Y, Shao W, Cheng Q, Shao X и др.. Золедроновая кислота ингибирует рост опухоли, не содержащей TSC2, посредством сигнального пути RhoA/YAP в моделях лимфангиолейомиоматоза у мышей. Раковая ячейка Интерн. (2020) 20:1–11. 10,1186/с12935-020-1131-4 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

21. Santolaria T, Robard M, Leger A, Catros V, Bonneville M, Scotet E. Повторные системные введения обоих аминобисфосфонатов и V9V2T-клетки человека эффективно контролируют развитие опухоли in vivo . Дж Иммунол. (2013) 191:1993–2000. 10.4049/jimmunol.1300255 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

22. Deniger DC, Switzer K, Mi T, Maiti S, Hurton L, Singh H, et al. Биспецифические Т-клетки, экспрессирующие поликлональный репертуар эндогенных γ δ Т-клеточные рецепторы и введенный CD19-специфический химерный антигенный рецептор. Мол Тер. (2013) 21:638–47. 10.1038/mt.2012.267 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

23. Themeli M, Kloss CC, Ciriello G, Fedorov VD, Perna F, Gonen M, et al. направленные Т-лимфоциты человека из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток для лечения рака. Нац биотехнолог. (2013) 31:928–33. 10.1038/nbt.2678 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

24. Brentjens RJ, Santos E, Nikhamin Y, Yeh R, Matsushita M, La Perle K, et al. . Генетически нацеленный T клетки эрадикируют ксенотрансплантаты системного острого лимфобластного лейкоза. Клин Рак Рез. (2007) 13:5426–35. 10.1158/1078-0432.CCR-07-0674 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

25. Casetti R, Perretta G, Taglioni A, Mattei M, Colizzi V, Dieli F, et al. Индуцированное лекарствами расширение и дифференцировка клеток Vd9Vg2T in vivo : роль экзогенного IL-2. Дж Иммунол. (2005) 175:1593–8. 10.4049/jimmunol.175.3.1593 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

26. Pillai V, Muralidharan K, Meng W, Bagashev A, Oldridge DA, Rosenthal J, et al. CAR Т-клеточная терапия эффективна для CD19-dim B-лимфобластного лейкоза, но на него влияет предшествующая терапия блинатумомабом. Кровь Adv. (2019) 3:3539–49. 10.1182/bloodadvances.201

92 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

27. Hartmann J, Schüßler-Lenz M, Bondanza A, Buchholz CJ. Клиническая разработка CAR-T-клеток — проблемы и возможности для воплощения инновационных концепций лечения.