Отзывы джили отака ск: Отзывы владельцев об автомобилях Geely CK (Otaka) (Джили ЦК Отака) на Авто.ру

Содержание

Отзывы владельцев об автомобилях Geely CK (Otaka) (Джили ЦК Отака) на Авто.ру

Плюсы

14 плюсов

3 Дизайн

2 Стоимость обслуживания

2 Надежность

2 Качество сборки

1 Шумоизоляция

Минусы

3 минуса

3 Коробка передач

Все плюсы и минусы

Двухлетний опыт владения

Geely CK (Otaka) 1.5 MT (94 л.с.)

На первых парах машинка порадовала своей небольшой ценой и количеством опций, т.к. брал я ее с рук у своего знакомого по цене вазовской 14 модели. Начнем с салона: Первый раз как сел за руль, бр

Год за рулем GEELY OTAKA N3

Geely CK (Otaka) 1.5 MT (94 л.с.)

Ну вот и прошел год на еще одной GEELY CK-1 (OTAKA rus) Покупали в мае 2012: б/у 2007 г.в. пробег 48000 км. комплектация «3» (с подушками). Цели и задачи: Дешево и сердито покататься по городу и

Отзыв автовладельца Geely CK (Otaka) 2007

Geely CK (Otaka) 1.5 MT (94 л.с.)

Автомобиль достался по обмену, скажу сразу, китайский производитель, так и останется китайским производителем! Дешёвая копия мерседеса снаружи и что то непонятное внутри! Салон светлый, электро паке

GEELY CK-1 или geely otaka

Geely CK (Otaka) 1.5 MT (94 л.с.)

Достойная машина, чуть меньше года владел, авто с пробегом, но за всё время не разу не лазил под капот, разве что, масло поменять и ремни. В подвеске вложений 15 т.р. Всё. Не прихотливая, очень эконом

Лучшее авто для стритрейсинга

Geely CK (Otaka) 1.5 MT (94 л.с.)

Здравствуйте! Вот и решил я вам поведать о своём авто. В мае 2008 я пошёл в автосалон «АИС» и купил свою ласточку . И с тех пор она меня ни разу не подвела. А называется моя машина Geely CK ! Все не

Об авто

Geely CK (Otaka) 1.5 MT (94 л.с.)

Джили ск очень даже хорошее авто в своем сегменте. Ездил и на ланосе и на приоре, есть с чем сравнивать, так вот джили единственная кто дотягивал до уровня «иномарка» . И по конфорту и по мощности,

Отзыв владельца про Geely CK (Otaka) 2007

Geely CK (Otaka) 1.5 MT (94 л.с.)

Авто — иномарка, но конечно же не форд! Зато и не такая, как наши) Дешевая в обслуживании, но есть и минусы. Главный минус это пластик. Дешевый и ломающийся, в остальном машинка бодрая! Юзал 7 лет — н

Джили ск2

Geely CK (Otaka) 1.5 MT (94 л.с.)

Джили ск, хороший надёжный автомобиль, хорошая ходовая, но лкп страдает очень быстро также клиренс небольшой, но это поправимо, поставил проставки в пружины и всё. Акб прожил 5 лет, купил новый. Поста

Китайская подделка

Geely CK (Otaka) 1.5 MT (94 л.с.)

Доброго всем времени суток! автомобиль достался мне почти даром. и почти новым. бывшему хозяину нужны были срочно деньги. езжу 2 месяца, теперь мне кажется они ему были не так срочно нужны, как избави

Geely Otaka — китайский автомобиль

Geely CK (Otaka) 1.5 MT (94 л.с.)

Geely Otaka — китайский автомобиль. Внешний вид — лучше ланоса и приоры. Внутри — бесспорно ланос и приора отдыхают, кресло немного неуютные, но и ладно. С з/ч проблем нет, стоят не так и дор

Всё о Geely CK (Otaka)

Рейтинг модели — 3.7 / 5

Отзывы владельцев Geely Otaka (Джили Отака) с фото, плюсы и минусы, достоинства и недостатки

Отзывы владельцев Geely Otaka (Джили Отака) с фото, плюсы и минусы, достоинства и недостатки — Авто Mail.ru —

Коробка передач

Объем двигателя, л

—Я брал свою джили в 2008 после ваз 2110 и до сих пор не нарадуюсь. Хоть и поменял все стойки,ручки ломаются внутренние, ну и некоторые мелочи.А двигателем я доволен, хоть и громкий.В-30 и ниже…

ДАННЫЕ МАШИНКИ БЫЛИ КУПЛЕНЫ ДЛЯ РАБОЧЕЙ ЦЕЛИ новыми в автосалоне Инком Авто в г. СПб Осенью 2007 года. На одну из них нашел файл с привязкой по пробегу, разместил, малоли кому-то пригодится =) На…

Несомненно радует список опций за малую цену, молодцы китайцы, правильный подход к российскому покупателю, многие попались на халяву теперь расхваливают как это хорошо и дёшево! Но про безопасность…

12 комментария

Набегал за пять лет немного—30 тысяч— хожу на работу пешком и езжу на большом авто. Зато в эти тысячи поместились три поездки в Абхазию и практически вся область. Поначалу не было отбоя от…

Пишу вам из Украины .Купил джилиху и доволен нормальный автомобильчик.До него были дэу и славута а также шеврол авео.На украине идет под индексом ск-2.Со сборкой правда повезло собрана в Китае…

автомобиль не мерс но для наших дорог хорош, на дороге устойчив, кушает мало. соотношение цена-качество +4 выше не поднять это потому что сборка Россия Новочеркасам оторвать бы руки — имею ввиду…

Не плохие впечатления поломок серьезных небыло .Полетел подшипник задней ступицы был удар проехал всего 22000 км.Мотор работает без перебоев тихо хотя немножко поднялись обороты двигателя. Рулевое…Машина покупалась чисто для нужд семьи а не для понтов.Сам работаю водилой 25 лет и ездил на всём,так что есть с чем сравнивать.В своём классе конечно предложение заманчивое.За такие даньги получаешь…

Сразу хочу начать с того что машина мне очень-очень понравилась ( когда продавал жалко было расстоваться,и сейчас скучаю по ней ) Продал её из-за того что нужны деньги. За всё время моего эксплуатации…

вобщем машинои я доволен двигатель экономичныи приемистыи салон устраивает единственныи не достаток очень слабоя ходовая часть и есть проблемы с запчястями внешнии вид вполне достоиныи дорогу машина…Когда выбирал авто, "Отака" понравилась.Сразу поразила не очень высокая цена при большом количестве опций.Немного смутило,что машина китайская,но успокоило,что сборка российская.Позже…

У меня это четвёртая машина,так что сравнивать есть с чем.Сразу порадовала комплектация:полный электропакет плюс магнитола prologi .Живу в деревне и что удивило-машина не "сосёт" пыль.В…

С учетом достаточно развитого в Украине сервиса этой марки авто могу сказать лишь одно: по соотношению "цена-потребительские качества" этому авто равных нет! Эргономика посадки не лучшая для…За такие деньги,конечно комплектация хорошая.Но безопасность оставяет желать всего самого наилучшего.При любом фронтальном ударе остаеться надееться на чудо,дабы остаться живым. Вообщем, жесть, всё…

1 комментарий

За такие деньги я доволен, лучше нашего дерьма (была ВАЗ 06, 09, 21101) хотя тоже новые брал, работает без проблем, В морозы — 41 даже заводил и ездил, только стекло плохо отогревается да и вообще…за полтора года наездил 33 тыщи км, до этой новых авто не было, но были разные — таврия, волга, москвич 41, опять таврия, жигули 07, опель кадетт дизель, фолькс — транспортёт, мерс — бусик. ни разу не…Приобрел один из последних автомобилей 2008-го года по цене со скидкой. Подкупил "полный фарш" за 56 000 грн (!!!). На момент покупки это был самый лучший автомобиль в своём классе… была 2110 , 1,6л 8 клап. отъездил 2 года, больших проблем не было. купил "отаку" выбирал по стоимости. проехал 59000 (рвался ремень кондиционера (для чайника это было страшно).проблем…когда купил думал вляпался — сервис только в москве, запчастей ноль, расходников нет-машину никто не знает-еще бы купил ее первый в городе. но в итоге отъездил целый год без приключений- отличные…В августе за 3 недели проехали 7500км (Челябинск-Украина), без проблем. Салон просторный. Везде пишут, что сиденье жесткое, но поверьте, что в 2007г. тоже ездили на Украину, на мягком сиденье. За дня…Помогите людям с выбором — расскажите о своем опыте использования автомобиля.

Написать отзыв

Отзыв Geely Otaka (Джили Отака) 2007 г. Часть 4

И снова всем привет! Сразу прошу прощения за нескладный текст, т.к. пивко уже ударило в голову, а отзыв очень хочется написать)!!!

Пришло время написать заключительную часть эпопеи нашей совместной жизни с автомобилем, придуманным в Китае и собранным на Украине — Джилли СК.

Автомобиль продан месяц назад с пробегом 93 000км. Так что буду максимально объективным.

За год владения данным автомобилем я проехал 36 000км, так что могу судить о его надёжности, т.к. эксплуатация была довольно жёсткой, дороги разбитые, точнее их уже как бы и нет, одни направления остались, плюс манеры езды у меня, мягко говоря, неспокойная)))!!!

Что было поменяно и отремонтировано, цена указана общая вместе с работой:

— замена масла «сшел хеликс» 4 раза + фильтра (150долл.)

— замена воздушного фильтра 2 раза (10 долл.)

— тормозные колодки передок 2 раза задок 1. (40 долл.)

— амортизаторы задние (110долл.)

— шаровые + задние стойки стабилизаторов (40долл.)

— ремни и ролики (130долл.)

Всё вместе получается 480 долл. Кто-то скажет, что много, но если посмотреть на перечень работ, то можно заметить, что всё это расходники!

Перейдём к общим впечатления. Буду писать по пунктам.

Экстерьер.

Кому-то нравится, кому-то нет. Но моё ИМХО, на 7000 долл. (цена нового авто) автомобиль смотрится отлично!!! Плюс чёрный цвет добавляет солидности, что ли, ну в принципе как и каждому авто.

Интерьер.

Мне очень нравится. Ни на что не похож и выглядит симпатично. Собран (в моём авто) нормально. Что очень не нравилось, так это пластик в районе магнитолы и стеклоподъёмников, очень легко царапается и теряется маломальский вид!!! Сиденья неудобные… от передних болит спина, задние низкие, но это чувствуешь только в дальних поездках.

Ходовые качества.

Не плохие, даже очень не плохие. Тяги двигателя хватает всегда, расход небольшой (в среднем 7 — 8 литров). Управляемость тоже хорошая, чувствуешь себя уверенно на любой дороге. Тормоза хорошие.

Надёжность.

Не подводила. ИМХО, автомобиль вполне надёжен. Ходовая отходила 80тыс вообще без проблем, не каждый авто в этом ценовом диапазоне сейчас этим может похвастаться (ох, чувствую тазоводы меня заплюют))))).

Вывод.

Не так страшен чёрт, как его малюют. Хороший автомобиль за свои деньги, но… чего-то в ней постоянно не хватает. Имени, харизмы или ещё чего-то… не могу сказать. Но в целом моя оценка «хорошо». За такие деньги покупка данного авто себя оправдывает. Машина отлично оснащена, надёжна, внешне смотрится поинтереснее многих одноклассников. Как для города отличный вариант!!! Для трассы очень лёгкая, хорошо сказывается на экономичности, но курсовая устойчивость страдает.

P.S. В последний день владения над авто немного поиздевался, сжёг немного резины, раскочегарил на трассе до предела — 170 км/ч (больше почему-то не поехала;), ну и т.д. джилька уехала к работнику милиции за те же деньги, что я её и приобрёл. Удачи ему с ней. Продал, т.к. нужен автомобиль, которого не жалко, с ходовой покрепче и с креслами поудобнее (постоянно в дороге!). Выбор пал… ох, смеяться будете… на опель аскона купе!!! Взял за 1300 долл. в неплохом состоянии, но это уже другая история, которой я поделюсь чуть позже. Сейчас в поисках ещё одного автомобиля, так сказать выходного дня…

Всем удачи на дорогах… Буду рад Вашим комментариям. Только, пожалуйста, без хамства…

полный каталог моделей, характеристики, отзывы на все автомобили Geely (Джили)

По-русски: Джили
Категория бренда: Китайские автомобили
Год основания:: 1984
Основатели:: Ли Шуфу
Количество моделей:: 17
Принадлежит:: Zhejiang Geely Holding Group Company Limited
Новостей на сайте:: 170 перейти
Наших тест-драйвов:: 16 перейти

Автомобили Geely

Atlas
1 поколение, 2018 — сегодня
Coolray
1 поколение, 2020 — сегодня
Emgrand
1 поколение, 2009 — сегодня
Emgrand 7
1 поколение, 2019 — сегодня
Emgrand EC7
2 поколения, 2010 — сегодня
Emgrand GS
1 поколение, 2018 — сегодня

Emgrand GT
1 поколение, 2017 — сегодня
Emgrand X7
2 поколения, 2013 — сегодня
GC6
1 поколение, 2014 — сегодня
GX7
1 поколение, 2011 — сегодня
MK
1 поколение, 2008 — сегодня
MK Cross
1 поколение, 2008 — сегодня

Otaka
1 поколение, 2005 — 2009
Preface
1 поколение, 2020 — сегодня
SX11
1 поколение, 2019 — сегодня
Tugella
1 поколение, 2020 — сегодня
Vision
1 поколение, 2008 — сегодня

О Geely

История китайской компании Geely Group, специализирующейся сегодня на выпуске недорогих автомобилей, началась с 1986 года. Однако первой продукцией компании были скутеры. В этой области к 1994 году Geely Group становится лидером на местном рынке. А в 2001 году Китайской Государственной Торгово-Экономической комиссией было принято решение о внесении машин компании Джили в государственный каталог автомобилей, что позволило ей стать первой частной кампанией на авторынке поднебесной. В 2003 году компания значительно расширяет свою сеть сбыта и начинает поставки своих машин в Центральную Азию, Африку и Америку. Кроме того, Geely Group открывает свои филиалы в Европе, России, США и Австралии.

Все модели Geely

geely otaka — Авторевю

Тип кузова: четырехдверный седан

Год испытания: 2007

Снаряженная масса (кг): 1052

VIN: X9121490170000254

Пассивная безопасность Отаки ниже всякой критики — в результате удара водительская дверь разрушена, пол пошел волнами, передняя стойка сместилась назад на 255 мм, а места для ног почти не осталось. Виной всему конструкция кузова и ужасное качество металла и сварки. Рулевая колонка сорвалась с креплений и руль, лишенный подушки безопасности, устремился навстречу «водителю». От удара «баранкой» голову развернуло и манекен приложился затылком о стойку лобового стекла с полуторакратным превышением критерия повреждения головы (HIC) — 1558. Вдобавок, «водитель» пробил коленями переднюю панель и сильно приложился ногами о поперечную трубу-усилитель. Фактически каждая часть тела человека за рулем Geely при подобном ударе подвержена высокому риску травмирования! Пассажир защищен лучше — критерии травмирования не превысили заведомо опасных пределов. В итоге Otaka заработала 1,7 балла из 16 возможных — и то лишь из-за невысоких нагрузок на «грудные клетки» от ремней безопасности, характерных для машин с «мягкими» кузовами).

<center><ins class="lazy lazy-hidden adsbygoogle" style="display:block; text-align:center;" data-ad-layout="in-article" data-ad-format="fluid" data-ad-client="ca-pub-5948177564140711" data-ad-slot="2646898692"></ins> <script>(adsbygoogle=window.adsbygoogle||[]).push({});</script></center>

Оснащение средствами пассивной безопасности
Преднатяжители передних ремней безопасности	нет
Ограничители усилия передних ремней безопасности	нет
Подушка безопасности водителя	нет
Подушка безопасности пассажира	нет
Боковые подушки безопасности	нет
«Занавески» безопасности	нет
Подушка безопасности для коленей водителя	нет

Китайские автомобили — Страница не найдена

Китайские автомобили

Форумы
Выбор
- Отзывы владельцев
- Краш-тесты
- Фото автомобилей
- Видеообзоры, тест-драйвы
- Статистика продаж
- Новости
Обслуживание
- Магазины запчастей
- Сервисы
- Документация
- Wiki-справочник
Каталог
- Все
- Легковые
- Кроссоверы
- Внедорожники
- Автобусы
- Грузовики
- Электромобили
Марки
- Все
- Haval
- Chery
- Geely
- Lifan
- Great Wall
- Dongfeng
- Changan
- Brilliance
- FAW
- Zotye
- Другие

Chery
- Tiggo 8
- Tiggo 8 Pro
- Tiggo 7 Pro
- Tiggo 5
- Tiggo 4
- Tiggo 3
- Tiggo 2
- CheryExeed TXL
- Tiggo FL
- Tiggo
- Другие
Geely
- Geely Atlas
- Geely Coolray
- Emgrand X7
- GS
- Tugella
- Emgrand EC7
- Другие
Haval
- Haval F7
- Haval F7x
- Haval Jolion
- Haval H6
- Haval H9
- Haval H5
- Другие
Lifan
- X70
- X60
- X50
- Murman
- Solano II
- Другие
Changan
- Changan CS35 Plus
- Changan CS35
- Changan CS55
- Changan CS75 FL
- Другие
Dongfeng
- DongFeng AX7
- DongFeng 580
- DongFeng h40 Cross
- DongFeng S30
- Другие
- Грузовики Dongfeng
FAW
- Besturn X80
- Besturn X40
- Другие
- Грузовики FAW
Great Wall
- Poer
- Wingle 7
- Hover H5
- Hover h4 New
- Hover h4
- Hover
- Wingle 5
- Safe
- Deer
- Другие
GAC
- GAC GS8
- GAC GS5
- GAC GN8
- Другие
JAC
- Jac S3
- Jac S5
- Jac S7
- Jac J7
- Jac T6
- Jac iEV7S
- Другие
Другие
- Автобусы ►
  - DongFeng
  - Golden Dragon
  - Higer
  - King Long
  - Mudan
  - SHEN LONG
  - Shuchi
  - Yutong
- Грузовики ►
  - BAW
  - Beifang
  - CAMC
  - DongFeng
  - FAW
  - Foton
  - JAC
  - Jinbei
  - JMC
  - Howo
  - Shaanxi
  - Yuejin
- BAIC
- Brilliance
- BYD
- Changfeng
- Foton
- Hafei
- Haima
- Hawtai
- JMC
- Landwind
- MG
- Qoros
- Roewe
- Zotye
- ZX Auto
- Другие…

Главная
Форумы
Отзывы владельцев
Краш-тесты
Фото, Видео
Дилеры
Документация, Wiki
Запчасти, сервис

Каталог автомобилей

Легковые
Кроссоверы
Внедорожники
Автобусы, грузовики
Электромобили

Статистика продаж
Иностранные бренды

У нас нет такой страницы :((

E-mail: [email protected]
Реклама на сайте
О нас

История марки Geely — CARobka.ru

Geely Automobile Holdings Limited — китайская автомобилестроительная компания, которая входит в Geely Holding Group. Штаб-квартира располагается в городе Ханчжоу. Компания занимается выпуском легковых автомобилей, внедорожников, мотоциклов, двигателей и трансмиссий. Она владеет брендами Geely и Volvo, а также продает такси под маркой London Taxi. В переводе с китайского название марки переводится как «счастье».

Основатель Geely — Ли Шуфу — родился в семье земледельца. Некоторое время мальчик помогал отцу, а затем отправился попытать счастья в городе. В 1986 году, когда Ли было 23 года, он основал фирму по производству компонентов для холодильных установок. Спустя три года он расширил деятельность и стал выпускать декоративные материалы и изделия из магнолиевого дерева.

В 1992 году намечается эпохальный поворот в истории развития компании: Geely подписывает договор о сотрудничестве с крупным японским автопроизводителем Honda Motor. Теперь марка по лицензии выпускает скутеры, мотоциклы и комплектующие. К 1994 году компания занимает лидирующие позиции по продаже скутеров на китайском рынке и начинает собирать мотоциклы собственной разработки.

Дела у компании шли превосходно: уже в 1997 году Geely выпускает более 200 000 мотоциклов и скутеров. С 1997 года компания оснащает мотороллеры силовыми агрегатами собственной разработки. Ли Шуфу планирует дальнейшее развитие и начинает разработку автомобилей.

В 1998 году появляется первый автомобиль Geely. Это был хетчбэк Haoqing SRV, основанный на платформе G100 Daihatsu Charade. Он комплектовался 993-кубовым трехцилиндровым или 1342-кубовым четырехцилиндровым силовым агрегатом мощностью 52 и 86 л.с. соответственно.

Haoqing SRV (1998)

В том же году стали выпускаться и другие модели семейства HQ. В 2000 году появляется малолитражка Geely MR, которая производится в кузове пятидверного хетчбэка и четырехдверного седана. Первоначально автомобиль вышел на рынок под именем Merrie. В 2005 году на автосалоне в Шанхае дебютировала его обновленная версия MR 203, которая уже комплектовалась 1,5-литровым двигателем.

Однако пока Geely не зарегистрирована как производитель автомобилей, что мешает компании начать полномасштабный выпуск. В 2001 году наконец-то получена лицензия, и Geely входит в число первых частных автопроизводителей Китая.

В 2002 году Geely начинает сотрудничать с Daewoo и Maggiora S.p.A Italy. А в следующем году компания экспортирует первую партию своих автомобилей. Только в первом полугодии объем выпуска автомобилей составляет 34 000 единиц.

В 2005 году предприятие впервые представляет свои автомобили на одной из престижнейших автомобильных выставок в мире — автосалоне во Франкфурте. Там продемонстрировали обновленный хетчбэк Haoqing, а также модели Merrie и Uliou. Geely стала первой китайской автокомпанией, которая представила свои авто на европейском рынке.

Спустя год марка демонстрировала свои модели на автошоу в Детройте. Затем компания показала собственные разработки: автоматическую трансмиссию и бензиновый 1-литровый двигатель мощностью 78 л.с.

В 2006 году представлен автомобиль Geely MK, который предлагается в кузове седан и хетчбэк. Он построен на базе Toyota Vios первого поколения. Эта модель появилась в России в 2008 году и стала настолько успешной, что с начала 2010 года ее выпуск был налажен на заводе Derways в Черкесске. Свою популярность она заслужила благодаря стильной внешности, просторному салону и надежности. В России Geely MK предлагается с 1,5-литровым двигателем мощностью 94 л.с.

Geely MK (2006)

В 2008 году в Детройте марка представила седан Geely FC, относящийся к классу «С hight» и заметно превосходящий своих предшественников по размерам. Он получил 16-клапанный мотор объемом 1,8 литра и мощностью 139 л.с., который позволяет разогнаться до 185 км/час.

С 2008 года марка начинает предлагать автомобили на природном газе и метаноле. В следующем году Geely заключает контракт с Yulon Group, который предусматривает совместный выпуск электромобилей.

В 2010-м Geely Automobile покупает у Ford Motor компанию Volvo Cars, заплатив 1,8 млрд долларов.

В 2009 году китайский автопроизводитель запускает новый бренд, под которым выводят на рынок автомобили класса люкс. Первым представителем семейства стал Emgrand EC7 — большой семейный автомобиль, запущенный в июле 2009 года. Он изначально разрабатывался как экспортная модель. При его изготовлении автокомпания использовала электронику Siemens, сиденья Lear Corporation и стекла Saint-Gobain. Emgrand EC7 стал первым автомобилем, созданным и разработанным в Китае, который по результатам тестов Euro NCAP получил 4 звезды.

Emgrand EC7 (2009)

В России марка была представлена с 2007 года, однако до 2011-го не имела единого официального представителя. 2 мая 2007 года в городе Новоуральске, на заводе ЗАО «АМУР», стартовало производство автомобилей Geely (CK) Otaka.

В 2011 году начинает свою деятельность ООО «ДЖИЛИ-МОТОРС», дочерняя компания Geely International Corporation, ставшая эксклюзивным дистрибьютором бренда в нашей стране. С этого момента продажи начали стремительно расти: если в 2011 году количество проданных автомобилей составило 6 060 единиц, то в 2013-м было реализовано уже более 27 000 единиц. Сегодня марка занимает первое место по объемам продаж в России среди китайских автопроизводителей.

В 2010 году Geely представляет еще один автомобиль бизнес-класса — флагманский Emgrand EC8, созданный на базе концепт-кара GC, дебютировавшего на автосалоне в Пекине в 2008 году. Он получил высокотехнологичный двигатель, полный комплект систем активной и пассивной безопасности и широкий список оснащения.

Emgrand EC8 (2010)

Сейчас компания Geely Automobile демонстрирует уверенный рост, продавая свои автомобили на всех континентах. Она реализует «Стратегию трансформации», предусматривающую переориентацию с политики снижения затрат при производстве на инновационные решения в дизайне, качестве, безопасности и технологичности.

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

SEC.gov | Превышен порог скорости запросов

Чтобы обеспечить равный доступ для всех пользователей, SEC оставляет за собой право ограничивать запросы, исходящие от необъявленных автоматизированных инструментов. Ваш запрос был идентифицирован как часть сети автоматизированных инструментов за пределами допустимой политики и будет обрабатываться до тех пор, пока не будут приняты меры по объявлению вашего трафика.

Пожалуйста, объявите свой трафик, обновив свой пользовательский агент, чтобы включить в него информацию о компании.

Для лучших практик по эффективной загрузке информации из SEC.gov, включая последние документы EDGAR, посетите sec.gov/developer. Вы также можете подписаться на рассылку обновлений по электронной почте о программе открытых данных SEC, включая передовые методы, которые делают загрузку данных более эффективной, и улучшения SEC.gov, которые могут повлиять на процессы загрузки по сценарию. Для получения дополнительной информации обращайтесь по адресу [email protected].

Для получения дополнительной информации см. Политику конфиденциальности и безопасности веб-сайта SEC. Благодарим вас за интерес к Комиссии по ценным бумагам и биржам США.

Идентификатор ссылки: 0.67fd733e.1627152922.22973bda

Дополнительная информация

Политика безопасности в Интернете

Используя этот сайт, вы соглашаетесь на мониторинг и аудит безопасности. В целях безопасности и обеспечения того, чтобы общедоступная услуга оставалась доступной для пользователей, эта правительственная компьютерная система использует программы для мониторинга сетевого трафика для выявления несанкционированных попыток загрузки или изменения информации или иного причинения ущерба, включая попытки отказать пользователям в обслуживании.

Несанкционированные попытки загрузить информацию и / или изменить информацию в любой части этого сайта строго запрещены и подлежат судебному преследованию в соответствии с Законом о компьютерном мошенничестве и злоупотреблениях 1986 года и Законом о защите национальной информационной инфраструктуры 1996 года (см. Раздел 18 U.S.C. §§ 1001 и 1030).

Чтобы обеспечить хорошую работу нашего веб-сайта для всех пользователей, SEC отслеживает частоту запросов на контент SEC.gov, чтобы гарантировать, что автоматический поиск не влияет на возможность доступа других лиц к контенту SEC.gov. Мы оставляем за собой право блокировать IP-адреса, которые отправляют чрезмерное количество запросов. Текущие правила ограничивают пользователей до 10 запросов в секунду, независимо от количества машин, используемых для отправки запросов.

Если пользователь или приложение отправляет более 10 запросов в секунду, дальнейшие запросы с IP-адреса (-ов) могут быть ограничены на короткий период.Как только количество запросов упадет ниже порогового значения на 10 минут, пользователь может возобновить доступ к контенту на SEC.gov. Эта практика SEC предназначена для ограничения чрезмерного автоматического поиска на SEC.gov и не предназначена и не ожидается, чтобы повлиять на людей, просматривающих веб-сайт SEC.gov.

Обратите внимание, что эта политика может измениться, поскольку SEC управляет SEC.gov, чтобы гарантировать, что веб-сайт работает эффективно и остается доступным для всех пользователей.

Примечание: Мы не предлагаем техническую поддержку для разработки или отладки процессов загрузки по сценарию.

Дельтакоронавирус свиней проникает в клетки двумя путями: один, опосредованный протеазой, на поверхности клетки, а другой — катепсинами в эндосоме

Дельтакоронавирус свиней (PDCoV) — патоген, принадлежащий к роду Deltacoronavirus , который в 2014 г. вызвал вспышки у свиней. диарея в США. Чтобы идентифицировать подходящие терапевтические мишени, требуется более полное понимание пути проникновения вируса, особенно роли протеаз.Здесь мы идентифицировали протеазы, которые активируют гликопротеин вирусного шипа (S), чтобы инициировать проникновение в клетку, а также точно определили пути клеточного пути, которые PDCoV использует для входа. Наши результаты показали, что катепсин L (CTSL) и катепсин B (CTSB) в лизосомах и внеклеточный трипсин в культурах клеток независимо активируют белок S для слияния мембран. Предварительная обработка клеток ингибитором закисления лизосом бафиломицином-A1 (Baf-A1) полностью ингибировала вход PDCoV, а опосредованное siRNA устранение экспрессии CTSL или CTSB значительно снижало вирусную инфекцию, что указывает на то, что PDCoV использует эндосомный путь для входа.Следует отметить, что обработка клеточных культур трипсином также активировала проникновение PDCoV, даже когда эндосомный путь ингибировался. Это наблюдение показало, что индуцированное трипсином расщепление и активация S-белка в культурах клеток делает возможным проникновение вируса непосредственно с поверхности клетки. Наши результаты дают критическое представление о механизме заражения PDCoV, раскрывая два различных пути проникновения вируса: один через катепсин L и катепсин B в эндосоме, а другой через протеазу на поверхности клетки. Поскольку сайты инфекции PDCoV представляют собой среду, богатую протеазами, эти находки указывают на то, что одного лечения ингибиторами эндосом недостаточно для блокирования проникновения PDCoV в эпителиальные клетки кишечника in vivo .Следовательно, следует также рассмотреть подходы, которые препятствуют проникновению вируса через клеточную мембрану.

вирусология

вирус

проникновение вируса

протеаза

протеолитический фермент

дельтакоронавирус свиньи

проникновение в клетки

катепсины

трипсин

мембранный диогенез

Рекомендуемые статьи Цитирующие статьи (0)

Цитирующие статьи

Nef-M1, пептидный антагонист CXCR4, ингибирует ангиогенез опухоли и эпителиально-мезенхимальный переход при раке толстой кишки и молочной железы

ВВЕДЕНИЕ

По оценкам Американского онкологического общества, 136 830 случаев колоректального рака (CRC) и 235 030 случаев инвазивного рака молочной железы (BC) в 2014 г. [1]. CRC является третьим по распространенности раком у мужчин и женщин в Америке, а BC — вторым по распространенности раком у женщин [1].Небольшие достижения в лечении CRC и BC за последние полвека существенно снизили смертность от запущенных заболеваний. Следовательно, идентификация новых лекарств, которые нацелены на онкогенные молекулярные пути и ингибируют прогрессирование опухоли, необходима для создания эффективных целевых методов лечения.

Ранее мы продемонстрировали, что апоптотический пептид из белка Nef вируса иммунодефицита человека-1 (ВИЧ-1), Nef-motif 1 (Nef-M1), был цитотоксичным для различных культивируемых линий раковых клеток человека, и мы охарактеризовали Nef -роль в активации апоптоза и подавлении опухолевого роста CRC или BC [2–4].В первоначальных исследованиях было показано, что Nef, миристоилированный белок 27–34 кДа, экспрессируемый на ранних этапах цикла инфекции в клетках-хозяевах [5], конкурирует с фактором 1-альфа, происходящим из стромальных клеток (SDF-1α), естественным лигандом CXC. хемокиновый рецептор 4 (CXCR4) и индуцируют апоптоз во время инфекции [6].

Определенные хемокины и их рецепторы, в частности SDF-1α и CXCR4, экспрессируются в различных эпителиальных раковых клетках и способствуют миграции, пролиферации и выживанию раковых клеток [7-15]. Было обнаружено, что экспрессия CXCR4 независимо связана с плохой выживаемостью пациентов с CRC и BC [16, 17].Ингибирование CXCR4 снижает ангиогенез опухоли [18, 19], а на модели мышей внутрибрюшинные ингибиторы CXCR4 значительно снижают неоваскуляризацию в опухолях [19].

Ангиогенез необходим как для роста опухоли, так и для метастазирования [20, 21]. Рост солидной опухоли требует развития новых кровеносных сосудов, и существуют корреляции между васкуляризацией, экспрессией проангиогенных факторов, биологической агрессивностью, высокой патологической степенью и плохой выживаемостью [22]. Приобретение мезенхимального фенотипа связано с прометастатическими свойствами, включая повышение мезенхимальных маркеров, повышенную подвижность, инвазию, лекарственную устойчивость, иммуносупрессию и характеристики раковых стволовых клеток (20).Ангиогенез опухолей и ЭМП являются ключевыми объектами современных исследований в области противоопухолевой терапии. Большинство современных методов лечения нацелены на фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и пути EMT. Однако не все опухоли реагируют на ингибиторы VEGF или EMT, а некоторые опухоли, которые изначально реагируют на блокаторы VEGF, могут стать устойчивыми во время лечения. Ангиоингибиторная роль пептида Nef-M1 и лежащие в основе молекулярные механизмы, связанные с Nef-M1 / CXCR4, не установлены при CRC и BC. Выяснение функции CXCR4 и его сигнального пути во время опухолевой прогрессии будет способствовать пониманию туморогенеза и метастазирования.Существует необходимость в изучении новых лекарств, направленных на ангиогенез опухоли и сигнальные пути. В этом отчете новинка определяет ангиоингибиторный эффект пептида Nef-M1 и исследует ингибирование процесса EMT в CRC и BC, которые связаны с комплексом пептид Nef-M1 / CXCR4.

РЕЗУЛЬТАТЫ

CXCR4 экспрессируется в опухолевых ксенотрансплантатах и родительских клетках рака толстой кишки человека

Мы исследовали экспрессию CXCR4 путем иммуноокрашивания опухолевых ксенотрансплантатов и их родительских человеческих клеточных линий CRC и BC.Иммуноокрашивание выявило экспрессию CXCR4 в ксенотрансплантатах, а также в родительских клетках CRC и BC человека, растущих in vitro (рис. 1A и 1B). Окрашивание ксенотрансплантатов H&E включено для сравнения тканей (рис. 1B). Экспрессия CXCR4 наблюдалась в ядре, клеточной мембране и цитоплазме CRC и BC. Экспрессию CXCR4 в лизатах опухолевых и родительских клеток подтверждали вестерн-блоттингом (данные не показаны).

Рисунок 1: Экспрессия CXCR4 в CRC и BC при иммуноокрашивании. A. Иммуноокрашивание подтвердило присутствие экспрессии CXCR4 в CRC (HT29) и BC (MDA-MB231). B. По сравнению с первичными поражениями CRC и BC, экспрессия CXCR4 была заметно увеличена в метастатических поражениях CRC и BC (красное окрашивание). Отрицательный контроль без первичных антител к CXCR4 использовали для демонстрации специфичности.

CXCR4 прогрессивно экспрессируется при запущенном заболевании

Сравнивали экспрессию CXCR4 в парных первичных и метастатических поражениях CRC и BC, полученных из ксенотрансплантатов.Экспрессия CXCR4 была значительно выше в метастатических опухолях, чем в соответствующих первичных опухолях того же животного (рис. 1B). Это говорит о том, что CXCR4 прогрессивно экспрессируется по мере того, как злокачественное заболевание становится более прогрессивным, таким образом, по-видимому, существует прямая связь с прогрессированием опухоли и метастазированием.

Пептид Nef-M1 индуцирует апоптоз

Антагонист CXCR4, пептид Nef-M1 активирует апоптоз в клетках CRC и BC in vitro [3, 4], но неизвестно, происходит ли это в интактных опухолях.Мы оценили эффекты пептида Nef-M1 на апоптоз в опухолях HT29 и MDA-MB231 с помощью анализа ник-конца терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы dUTP (TUNEL). Наблюдалось усиление мечения TUNEL (маркировка зеленым пунктиром) на сайтах расщепления ДНК в опухолях, обработанных Nef-M1 (рис. 2А). Процент ядер, меченных TUNEL, в опухолях HT29 и MDA-MB231 от мышей, обработанных пептидом Nef-M1, составлял 85% и 89,3% соответственно. Индуцирование апоптоза Nef-M1 сопровождалось наличием более активированной каспазы-3 в опухолях мышей, получавших Nef-M1 (фиг. 2B), чем у мышей, получавших sNef-M1.

Рис. 2: Анализ TUNEL на парафиновых срезах репрезентативных CRC и BC, окрашенных DAPI. A. Образцы, обработанные пептидом Nef-M1, демонстрируют повышенную ядерную фрагментацию и мечение фрагментов в сайтах расщепления ДНК (интенсивное зеленое окрашивание). B. Вестерн-блот-анализ активации каспазы-3 на лизатах опухолей. Пептид Nef-M1 индуцировал апоптоз, на что указывает присутствие повышенных уровней активированной каспазы-3 в образцах, обработанных Nef-M1.

Пептид Nef-M1 ингибирует ангиогенез опухоли

Эффект пептида Nef-M1 на ангиогенез опухоли первоначально оценивали путем иммуноокрашивания на эндотелиальный маркер CD31, маркер хорошо установленной васкулярности. Мышей лечили пептидом Nef-M1 или sNef-M1, начиная с момента имплантации опухоли. Иммуноокрашивание на CD31 показало, что контрольные опухоли (обработанные пептидом sNef-M1) имели хорошо установленную васкуляризацию, но опухоли, обработанные пептидом Nef-M1, имели плохую васкуляризацию как для CRC (рис. 3), так и для BC (рис. 4).Высокая экспрессия CD31in в опухолях связана с высокой степенью ангиогенеза, что подразумевает быстрый рост [22]. Средняя плотность микрососудов (MVD) была снижена в опухолях, обработанных пептидом Nef-M1 ( n = 5), по сравнению с опухолями, обработанными пептидом sNef-M1 ( n = 5) в CRC (Фигуры 3A и 3B). В РМЖ средний MVD был аналогичным образом снижен в опухолях, обработанных пептидом Nef-M1 ( n = 4), по сравнению с контрольными опухолями пептида sNef-M1 ( n = 5) (рис. 4A и 4B).Ткань, обработанная Nef-M1, имеет плохую морфологию и потерю целостности эндотелия (рис. 3C и 4C) как в CRC, так и в BC. Таким образом, контрольные опухоли (обработанные пептидом sNef-M1) сохраняли хорошо установленную васкуляризацию, в то время как пептид Nef-M1 значительно снижал васкуляризацию опухоли.

Фиг. 3. Эффект пептида Nef-M1 на ангиогенез CRC, как определено с помощью иммуноокрашивания на эндотелиальный маркер CD31. A. Репрезентативные изображения окрашенных срезов CRC мышей, обработанных пептидом sNef-M1 или Nef-M1 (увеличение x200).Микрососуды были идентифицированы на основе их морфологии и выделены CD31-иммунореактивными эндотелиальными клетками. B. Средняя плотность микрососудов, определяемая как количество внутриопухолевых сосудов из полей в срезах CRC от мышей, обработанных пептидом sNef-M1 или Nef-M1. Количественное определение плотности микрососудов показывает значительное ингибирование ангиогенеза опухоли пептидом Nef-M1. C. Морфология, связанная с лечением. Ткань, обработанная Nef-M1, имеет плохую морфологию и потерю целостности эндотелия. D. Белок VEGF-A оценивали с помощью вестерн-блоттинга в лизате опухолей мышей, обработанных пептидом sNef-M1 или Nef-M1. Nef-M1 снижает экспрессию VEGF-A в CRC. E. Белок VEGF-A оценивали с помощью вестерн-блоттинга в лизате клеток HT29, обработанных пептидом sNef-M1 или Nef-M1. Nef-M1 снижает экспрессию VEGF-A в клетках HT29. F. Белок VEGF-A оценивали с помощью ELISA в кондиционированной среде клеток HT29, обработанных пептидом sNef-M1 или Nef-M1. Пептид Nef-M1 ингибировал секрецию VEGF-A. G. Влияние пептида Nef-M1 на образование трубок HUVEC. Неф-М1 ингибировал образование капиллярной сети.

Фиг. 4. Эффект пептида Nef-M1 на ангиогенез РМЖ, определенный с помощью иммуноокрашивания на CD31. A. Микрососуды идентифицировали на основании их морфологии в микрососудах, выделенных CD31-иммунореактивными эндотелиальными клетками. B. Nef-M1 значительно ингибировал ангиогенез опухоли. C. Неф-М1 нарушил морфологию сосудов. D. Белок VEGF-A оценивали с помощью вестерн-блоттинга в лизате опухолей мышей, обработанных пептидом sNef-M1 или Nef-M1. Nef-M1 снижает экспрессию VEGF-A в BC. E. Белок VEGF-A оценивали с помощью вестерн-блоттинга в лизате клеток MDA-MB231, обработанных пептидом sNef-M1 или Nef-M1. Nef-M1 снижает экспрессию VEGF-A в клетках MDA-MB231. F. Белок VEGF-A оценивали с помощью ELISA в кондиционированной среде клеток MDA-MB231, обработанных пептидом sNef-M1 или Nef-M1. Пептид Nef-M1 ингибировал продукцию VEGF-A. G. Влияние пептида Nef-M1 на образование трубок HUVEC. Неф-М1 ингибировал образование капиллярной сети.

Пептид

Nef-M1 снижает экспрессию VEGF-A в CRC и BC

VEGF-A является ключевым проангиогенным фактором, высвобождаемым из раковых клеток, который стимулирует васкулогенез и ангиогенез [23]. В микроокружении опухоли раковые клетки секретируют высокий уровень VEGF, который связывается с рецепторами на окружающих эндотелиальных клетках, способствуя миграции, пролиферации, дифференцировке и образованию трубок эндотелиальных клеток [23].Вестерн-блоттинг лизатов опухолей мышей выявил значительно меньше белка VEGF-A в опухолях от мышей, получавших Nef-M1, чем в опухолях от мышей, получавших sNef-M1 (фиг. 3D и 4D). Аналогичным образом, вестерн-блоттинг лизатов клеток CRC и BC показал, что белок VEGF-A был значительно снижен в клетках, обработанных пептидом Nef-M1, по сравнению с клетками, обработанными контрольными образцами пептида sNef-M1 (рис. 3E и 4E). ELISA секреции VEGF линиями клеток CRC и BC выявил заметно сниженные уровни VEGF в клетках CRC и BC, обработанных Nef-M1 (фиг. 3F и 4F).

Пептид Nef-M1 ингибирует образование канальцев эндотелиальных клеток

HUVEC образуют трубчатые структуры на матригеле, что является важным первым шагом в ангиогенезе. Поэтому затем мы исследовали образование канальцев с помощью HUVEC в матригеле, чтобы показать прямое влияние пептида Nef-M1 на функцию эндотелиальных клеток. HUVEC высевали с плотностью 5 × 10 ⁴ / лунку в отдельные лунки 96-луночного кластерного планшета, покрытого матригелем, в присутствии кондиционированной среды, собранной либо из пептида Nef-M1, либо из обработанного пептидом sNef-M1 CRC или BC. клетки.Кондиционированная среда из клеток CRC и BC, обработанных sNef-M1, стимулировала HUVEC к образованию сетей из множества трубчатых структур, в то время как кондиционированная среда из клеток CRC и BC, обработанных Nef-M1, не поддерживала образование канальцев аналогично кондиционированной среде. (Рисунок 3G и 4G).

Пептид Nef-M1 ингибирует процесс EMT

Оценивали влияние пептида Nef-M1 на развитие молекулярных сигнатур, связанных с EMT. EMT — это фенотипическое преобразование, которое способствует развитию неоплазии и связано с прогрессированием опухоли и метастазированием [24].Во время этого процесса E-кадгерин (эпителиальный маркер) подавляется, а виментин, фибринектин и p-GSK-3B (мезенхимальные маркеры) активируются. Обработанные Nef-M1 опухолевые клетки, проанализированные с помощью вестерн-блоттинга, показали повышенную экспрессию эпителиальной сигнатуры E-кадгерина и сниженную экспрессию мезенхимальной сигнатуры виментина, фибронектина и p-GSK-3β (фиг. 5A и 5B). Вестерн-блоттинг лизатов опухолей ксенотрансплантатов мыши также выявил значительно повышенную экспрессию белка E-кадгерина и снижение экспрессии мезенхимальных сигнатурных белков виментина, фибронектина и p-GSK-3β в опухолях мышей, которым вводили Nef-M1, по сравнению с опухолями. от контрольных мышей, получавших sNef-M1 (данные не показаны).Эти результаты показывают, что Nef-M1 может ингибировать прогрессирование опухоли путем ингибирования процесса EMT.

Рисунок 5: Пептид Nef-M1 ингибирует ЕМТ в клетках CRC и BC. Вестерн-блоттинг показал повышенную экспрессию E-кадгерина и снижение экспрессии виментина, фибронектина и p-GSK-3β в клетках CRC A. и BC B. , обработанных пептидом Nef-M1.

Пептид Nef-M1 ингибирует опухолевый ангиогенез и процесс EMT в клетках BC посредством CXCR4

Передача сигналов CXCR4 часто активируется при раке человека [25].Было обнаружено, что CXCR4 связан с несколькими клеточными путями, включая пролиферацию и апоптоз [26–30]. Повышенная экспрессия этого рецептора и его лиганда SDF-1α была описана при нескольких злокачественных новообразованиях [31]. Экспрессия CXCR4 необходима для инициации и прогрессирования опухоли [25]. Кроме того, ранее мы показали, что пептид Nef-M1 индуцирует апоптоз через рецептор CXCR4 [6]. Мы сообщили, что линия клеток опухоли молочной железы MDA-MB468, которая не экспрессирует CXCR4, резистентна к апоптозу, индуцированному Nef-M1 [6].Чтобы дополнительно подтвердить взаимосвязь между экспрессией CXCR4, чувствительностью Nef-M1 и выживаемостью клеток, мы временно трансфицировали клетки MDA-MB468 экспрессирующим вектором pCMV-CXCR4. Экспрессия CXCR4 в этих клетках была подтверждена с помощью иммунофлуоресценции (локализация в зеленой цитоплазме и клеточной мембране) и вестерн-блоттинга (рис. 6А и 6В). Значительное увеличение выживаемости клеток наблюдалось в клетках, трансфицированных CXCR4, по сравнению с выживаемостью в нетрансфицированных клетках. Выживаемость также увеличивалась в клетках, экспрессирующих CXCR4, и в присутствии лиганда CXCR4 SDF-1α (фиг. 6A).CXCR4 индуцировал образование трубки (рис. 6С) и морфологические изменения, включая поляризацию клеток и расширение инвадоподий, связанных с прогрессированием опухоли (рис. 6А). SDF-1α индуцировал интернализацию CXCR4 в клетках MDA-MB468, о чем свидетельствует конфокальная микроскопия (рис. 6А). Экспрессия CXCR4 в клетках BC была связана с повышенной экспрессией VEGF-A (фиг. 6C), виментина и p-GSK-3β и снижением экспрессии E-кадгерина (фиг. 6B и 6D).

Рисунок 6: A. Пролиферация и морфологические особенности клеток MDA-MB468, сверхэкспрессирующих CXCR4.Морфологические изменения клеток показаны на фазово-контрастных изображениях. CXCR4 и его лиганд SDF-1α индуцируют пролиферацию и морфологические изменения, связанные с прогрессированием опухоли. SDF-1α индуцирует интернализацию CXCR4. B. Лизаты клеток из контрольных MDA-MB468 или клеток, экспрессирующих CXCR4, подвергали иммуноблоттингу с антителами против CXCR4, E-кадгерина, p-GSK-3β, VEGF-A или β-актина. Клетки, экспрессирующие CXCR4, становились восприимчивыми к индуцированному пептидом Nef-M1 ингибированию экспрессии p-GSK-3β (мезенхимальная сигнатура), экспрессии VEGF-A (ангиогенез опухоли) и индуцированному повышению E-кадгерина (эпителиальная сигнатура). C. Клетки, которые экспрессируют CXCR4, стали восприимчивыми к индуцированному пептидом Nef-M1 ингибированию образования капиллярной сети и экспрессии VEGF-A, как обнаружено с помощью анализа образования пробирки и иммунофлуоресценции соответственно. D. Клетки, которые экспрессируют CXCR4, стали восприимчивыми к индуцированному пептидом Nef-M1 повышению E-кадгерина (эпителиальная сигнатура) и ингибированию экспрессии виментина (мезенхимальная сигнатура), как обнаружено иммунофлуоресцентным анализом.

Учитывая потенциальную роль CXCR4 в онкогенезе, клетки MDA-MB468 затем использовали для изучения того, ингибирует ли пептид Nef-M1 ангиогенез опухоли и ЕМТ через рецептор CXCR4.Мы наблюдали, что клетки, трансфицированные pCMV-CXCR4, становились восприимчивыми к индуцированному Nef-M1 ингибированию развития сети из множества трубчатых структур, а также проявляли сниженную экспрессию VEGF (ангиогенез) (Фиг.6B и 6C). Кроме того, клетки, экспрессирующие CXCR4, стали восприимчивыми к индуцированному Nef-M1 ингибированию экспрессии p-GSK-3β и виментина (мезенхимальная сигнатура) (фиг. 6B и 6D), а также к индуцированному Nef-M1 повышению E-кадгерина (эпителиальная сигнатура) (фиг. 6B и 6D). Эти данные убедительно свидетельствуют о том, что CXCR4 является потенциальной мишенью для пептида Nef-M1 при ингибировании ангиогенеза опухоли и онкогенного процесса EMT.

ОБСУЖДЕНИЕ

Ранее нами было показано, что пептид Nef-M1 цитотоксичен и подавляет рост CRC и BC [2–4]. Наша настоящая работа демонстрирует, что пептид Nef-M1 также ингибирует ангиогенез опухоли как in vitro , так и in vivo . Ингибирование ангиогенеза опухоли пептидом Nef-M1 коррелирует со снижением экспрессии VEGF-A. Более того, пептид Nef-M1 также ингибирует ЕМП.

Хемокиновые рецепторы, которые принадлежат к семейству рецепторов, связанных с G-белком, участвуют в регуляции иммунного ответа, воспаления, переноса лейкоцитов и перестройки цитоскелета [32].Хемокиновый рецептор / лиганд CXCR4 / SDF-1α уникален тем, что SDF-1α является единственным известным лигандом для этого рецептора [33–36]. CXCR4 является наиболее распространенным рецептором хемокинов при солидном раке человека, включая рак груди [37], меланому [8], почечные клетки [38], мозг [9, 39], щитовидную железу [10, 40], немелкоклеточные легкие [11]. , 41], поджелудочной железы [12, 42], яичников [13, 43], простаты [14, 44] и колоректального рака [15, 45]. Активация молекулярных путей, таких как митоген-активируемая протеинкиназа p38 (p38 MAPK), вызывает прогрессирование опухоли и связана с экспрессией CXCR4 [26–28].Экспрессия CXCR4 выше в эмбриональных или дедифференцированных клетках, чем в нормальных клетках [46], а экспрессия CXCR4 независимо предсказывает плохую выживаемость в опухолях [47]. В соответствии с предыдущими исследованиями, это исследование показало, что экспрессия CXCR4 значительно увеличилась в метастатических поражениях опухолей по сравнению с первичными поражениями опухолей как в CRC, так и в BC. Важно изучить новые препараты, которые нацелены на CXCR4 или прерывают комплекс SDF-1α / CXCR4, которые могут иметь сильное влияние в качестве терапевтического агента для подавления прогрессирования опухоли.

Разработаны агенты, специально направленные против рецептора CXCR4 [48, 49]. Блокируя взаимодействие рецептора с его естественным лигандом, можно добиться подавления роста первичной опухоли и метастазирования [50]. Эти синтетические антагонисты CXCR4, первоначально созданные для борьбы с ВИЧ-1, не уничтожают клетки, а скорее конкурируют с лигандом SDF-1α, подавляя клеточную функцию. Важно отметить четкое различие между этими агентами и пептидом Nef-M1. Пептид Nef-M1 вызывает апоптоз в опухолевых клетках, тем самым уничтожая клетку.Nef-M1 эффективно активирует каспазу-3, ключевую молекулу апоптотического процесса, in vivo . Действительно, высокий процент ядер, меченных TUNEL, в опухолях мышей, получавших пептид Nef-M1, демонстрирует параллельную индукцию апоптоза этим пептидом. Интересно, что недавнее исследование показало, что SIVmac239-Nef снижает экспрессию CXCR4 на клеточной поверхности в клетках COS-7 и снижает пролиферацию и миграцию опухолевых клеток [51]. Однако SIVmac239-Nef не влияет на активацию каспазы 3, и нет сходства последовательностей между пептидом Nef-M1 и SIVmac239-Nef, хотя оба являются подмножествами полного белка Nef.Кроме того, поскольку SIVmac239-Nef не вызывает апоптоз, он не уничтожает раковые клетки, как это делает Nef-M1. Наши предыдущие и текущие исследования показывают, что пептид Nef-M1 является потенциальным терапевтическим агентом, который можно использовать для нацеливания на CXCR4 для индукции апоптоза в CRC и BC.

Имплантация, рост и метастазирование опухоли коррелируют с неоваскуляризацией и ангиогенезом [52, 53]. Васкуляризация опухоли возможна за счет прорастания ангиогенеза из уже существующих сосудов или за счет привлечения циркулирующих эндотелиальных клеток или предшественников, которые могут вносить вклад в разной степени в зависимости от молекулярного контекста [54-56].Эндотелиальные клетки стимулируются высвобождаемыми опухолью факторами роста для миграции и деления в месте опухоли, в конечном итоге формируя трубки кровеносных сосудов, стабилизированные гладкомышечными клетками [57].

Ангиогенные факторы действуют через множество сигнальных путей. Путь VEGF и передача сигналов Notch являются двумя наиболее важными механизмами, связанными с развитием эмбриональных сосудов и ангиогенезом опухолей [58, 59]. Повышенная экспрессия CXCR4 вызывает метастазирование опухоли за счет усиленной пролиферации клеток за счет активации молекулярных путей [29] и за счет ускорения васкуляризации за счет активации VEGF [17].Передача сигналов CXCR4 [30], которая увеличивает активность промотора VEGF-A [60], может способствовать ангиогенезу и, таким образом, повышать жизнеспособность опухоли. Мы демонстрируем здесь, что экспрессия CXCR4 в клетках BC связана с повышенной экспрессией VEGF-A. Повышенная экспрессия VEGF и его рецепторов коррелирует с увеличением MVD, пролиферации клеток и скорости роста опухоли, что ухудшает выживаемость пациентов при различных формах рака [23, 61, 62]. Хотя здесь мы сосредоточились на VEGF, существует множество других проангиогенных факторов роста, таких как факторы роста фибробластов (FGF) [63], фактор роста плаценты (PIGF) [64] и фактор роста тромбоцитов (PDGF) [65]. .Каждый из этих проангиогенных факторов роста также регулирует ангиогенез посредством передачи сигналов, опосредованной CXCR4 [66]. Следовательно, CXCR4 является привлекательной мишенью, поскольку он является наиболее распространенным рецептором хемокинов, экспрессируемым в раковых клетках и коррелирующим с факторами, связанными с ангиогенезом. Таким образом, нацеливание на CXCR4 подходящим терапевтическим агентом может быть средством контроля прогрессирования опухоли. Мы показали ингибирующую роль Nef-M1 на ангиогенез опухоли и экспрессию VEGF-A. Это исследование также продемонстрировало корреляцию между сниженной экспрессией VEGF-A и ингибированием ангиогенеза опухоли как в опухолях, так и в соответствующих родительских клетках, предполагая, что пептид Nef-M1 может ингибировать ангиогенез опухоли путем ингибирования механизма передачи сигналов CXCR4 / VEGF в CRC и BC.

EMT, изменение эпителиального фенотипа на мезенхимальный фенотип, является важной характеристикой раковых стволовых клеток [67]. CXCR4 является ключевым регулятором процесса EMT, посредством которого он может активировать сигналы, связанные с прогрессированием опухоли [68]. Блокада передачи сигналов SDF-1 / CXCR4 ингибирует экспрессию MMP-9 и виментина [69], фенотипов, связанных с инвазией, которые, как известно, способствуют передаче сигналов метастазов. Настоящее исследование продемонстрировало, что Nef-M1 нацелен на CXCR4, ингибирует EMT и подавляет прогрессирование опухоли.

Экспрессия

VEGF более выражена в раковых клетках, экспрессирующих CXCR4 [70]. Настоящее исследование продемонстрировало значительную связь между CXCR4 и выживаемостью клеток. Поскольку было обнаружено, что экспрессия CXCR4 в клетках BC связана с повышенным образованием трубок (ангиогенезом) и индукцией EMT, мы использовали линию клеток BC, которая не экспрессирует CXCR4, чтобы изучить, ингибирует ли пептид Nef-M1 ангиогенез или процесс EMT. через рецептор CXCR4. Действительно, клетки, экспрессирующие CXCR4, стали уязвимыми для индуцированного пептидом Nef-M1 ингибирования образования трубок и снижения экспрессии VEGF (ангиогенеза).Более того, клетки, которые экспрессируют CXCR4, становятся восприимчивыми к сдвигу от более мезенхимального к более эпителиальному профилю в ответ на Nef-M1. Эти данные убедительно свидетельствуют о том, что CXCR4 является потенциальной мишенью для пептида Nef-M1 при ингибировании опухолевого ангиогенеза и онкогенного процесса EMT как при CRC, так и при РМЖ.

Хотя необходимы дополнительные исследования для выяснения молекулярных механизмов, которые способствуют ангиоингибиторной активности пептида Nef-M1, наши результаты предполагают, что пептид Nef-M1 может быть потенциальным ведущим соединением для терапевтического применения для лечения рака.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Пептиды и антитела

Пептиды Nef-M1 и sNef-M1 были получены от CPC Scientific Inc (Саннивейл, Калифорния). Антитела, использованные в этом исследовании, были приобретены у Cell Signaling Technology Inc (Данверс, Массачусетс), Novus Biologicals (Литтлтон, Колорадо), Santa Cruz Biotechnology Inc (Даллас, Техас), Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури) и Abcam (Кембридж, США). MA). Информация о первичных антителах представлена в таблице 1.

Таблица 1: Подробная информация о первичных антителах, использованных в этом исследовании

1: 500

S.№	Антитело	Каталожный номер	Хост	Клональность	IF	Компания	Компания 902	Разведения для WB
1	CXCR4	NB600-786	onal	1: 1000
2	β-actin	4967S	Rabbit	Rabbit	902 —	900 02 1: 1000
3	VEGF-A	Sc-507	Кролик	62 Поликлональный			1: 1000
4	CD31	Ab28364	Кролик	3
5	E-кадгерин	Sc-7870	Кролик	Поликлональный		Санта-Круз9 : 1000
6	Виментин	3932S	Rabbit	Поликлональная	Технология передачи сигналов сотовой связи	1: 500	1: 100030003
1: 100030003
F3648	Кролик	Поликлональный	Sigma-Aldrich	—	1: 1000
0
9323P	Rabbit	Monoclonal	Технология передачи сигналов ячеек	—	1: 1000	9 62 1: 1000 Cleved-	3	9664p	Ra bbit	Моноклональная	Технология передачи сигналов ячеек	—	1: 1000

IHC; Иммуногистохимия, IF; Иммунофлуоресценция, WB; Вестерн-блот

Животные и инъекции пептида Nef-M1

Животные и рост опухоли

Мышей с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID) получали от Taconic Farm (Taconic, NY) в возрасте приблизительно одного месяца.После одной недели карантина мышам прививали клетки толстой кишки (HT29) и рака груди (MDA-MB-231) (1 × 10 ⁶ клеток / 0,1 куб. См) подкожно с использованием сбалансированного солевого раствора Хенкса для установления первичных опухолей. Животные получали стандартный корм для грызунов и воду и содержались в изолированных микрофильтрованных клетках в помещениях, предназначенных для мышей с ослабленным иммунитетом. Мышей ежедневно проверяли для оценки состояния здоровья и роста опухоли. Вес тела, количество питательных веществ, общий уровень активности и взъерошенность шерсти мышей служили индикаторами состояния здоровья.Хирургические процедуры выполнялись с использованием одноразовых халатов, стерильных перчаток и капюшона с ламинарным потоком. Руки в перчатках были смочены жидким стерилизатором перед непосредственным контактом с мышами.

Хирургические процедуры

Все хирургические процедуры проводились в соответствии с рекомендациями и одобрениями IACUC.

Имплантация опухоли

В случае тканевых имплантатов после развития солидной опухоли после инъекции клеток солидную опухоль разрезали на 2–4 мм кусочки в бессывороточной культуральной среде и хранили при 4 ° C до использования.Мышей успокаивали, используя 0,6 мл авертина (2, 2, 2-трибромэтанол и 2-метил-2-бутанол). Опухоли были имплантированы в subQ. Все хирургические закрытия ран производились рассасывающимся швом 5–0 или кожными скобами. После имплантации мышей помещали под тепловую лампу на 10 мин для восстановления, а затем снова помещали в клетки. Примерно через два часа после процедуры мы снова проверяем на полное выздоровление и стабильность.

Обработка Nef M1

Мышам SCID вводили внутрибрюшинно через одну неделю после имплантации опухоли либо активный пептид Nef M1, либо скремблированную аминокислотную последовательность пептида Nef-M1 (sNef-M1).Каждая группа лечения представляет не менее 5 мышей. Разведения пептида Nef проводили в фосфатном буферном солевом растворе (PBS) в концентрации 2 мкг на 0,1 мл, как было оптимизировано, и инъекции пептида Nef-M1 выполняли каждые две недели в течение четырех недель для всех групп лечения, как описано в наших предыдущих отчетах. Для исследований in vitro на культуре клеток разведения и концентрации пептида Nef-M1 или пептида sNef-M1 (100 нг / мл) были выполнены в соответствии с ранее описанным протоколом [2–4]. Вкратце, реакцию на дозу оценивали путем инкубации 2.5 × 10 ⁵ раковых клеток с пептидом Nef-M1 или пептидом sNef-M1 в различных концентрациях в многостенных 35-миллиметровых планшетах в течение 24 часов. Концентрации пептида Nef-M1 составляли 0, 0,01, 0,1, 1, 10 и 100 нг / мл. Дозовый ответ пептида Nef-M1 определяли с помощью мечения ник-конца терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы dUTP (4).

Модель метастаза

Модель мыши SCID

была использована для установления метастатического поражения печени, как описано в нашей более ранней версии (2). Метастазы в печени получали путем инъекции клеток HT29 и MBA-MD231, линии, происходящей от первичной карциномы толстой кишки и груди, в селезенку с количеством клеток (1 × 10 ⁶ клеток / 0.1 куб. Вкратце, инъекции в селезенку выполнялись путем экстракорпоральной инъекции селезенки под прямым наблюдением с последующей заменой селезенки в ее обычном анатомическом месте. Печень была удалена у мышей при вскрытии. Количество грубых повреждений печени подсчитывали с помощью увеличительной линзы. Эти поражения и соответствующие первичные опухоли использовали для оценки статуса прогрессивной экспрессии CXCR4.

TUNEL assay

Для оценки апоптоза были выполнены тесты TUNEL с набором для определения гибели клеток in situ (EMD Millipore, Billerica MA).Процедура иммуногистохимического обнаружения и количественной оценки апоптоза была основана на маркировке разрывов ДНК. Депарафинизацию срезов ткани проводили ксилолом с последующей процедурой регидратации с помощью ряда растворов этанола (100%, 95%, 80% и 50%). Срезы тканей промывали 1xPBS и инкубировали в растворе для повышения проницаемости (0,1% Triton X-100, 0,1 цитрат натрия) в течение 10 минут при комнатной температуре. Срезы промывали 1xPBS и добавляли 50 мкл реакционной смеси TUNEL, состоящей из TdT и биотинилированных нуклеотидов.Клетки инкубировали в увлажненной камере в течение 1 ч при 37 ° C и трижды промывали 1xPBS. Конфокальные изображения были получены с использованием конфокального лазерного сканирующего микроскопа Olympus FluoView FV1000 (Olympus America, Inc., Center Valley, PA), сконфигурированного на полностью автоматизированном инвертированном микроскопе Ix81 с использованием масляного объектива 40x UPLFLN (NA1.3). Был проведен вестерн-блот-анализ активации каспазы-3 в лизатах образцов CRC и BC. Активацию каспазы-3 определяли с помощью вестерн-блоттинга, идентифицирующего расщепление 32 кДа протеина прокаспазы-3 на два меньших протеина каспазы-3 17 и 12 кДа.

Культуры клеток, трансфекции и обработка

Использовали одну линию клеток CRC (HT29), две линии клеток BC (MDA-MB231 и MDA-MB468) и одну линию эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC). Каждая клеточная линия была первоначально приобретена из Американской коллекции типовых культур (АТСС, Манассас, Вирджиния) и заморожена. Клеточные линии CRC и BC культивировали в 5% CO ₂ при 37 ° C в среде RPMI 1640 (Life Technologies, Grand Island, NY) с добавлением L-глутамина, 10% фетальной бычьей сыворотки (Life Technologies) и пенициллина ( 100 Ед / мл) / стрептомицин (100 Ед / мл) (Life Technologies).Клетки HUVEC культивировали в базальной среде сосудистых клеток (ATCC) с добавками для роста из набора для роста эндотелиальных клеток — VEGF (ATCC) и пенициллина (100 Ед / мл) / стрептомицина (100 Ед / мл). Разведения и концентрации пептида Nef-M1 или пептида sNef-M1 (100 нг / мл) были выполнены в соответствии с ранее описанным протоколом [2–4]. Культуры клеток выращивали до 80% конфлюэнтности и обрабатывали пептидом sNef-M1 или Nef-M1 в соответствии с установленным протоколом.

Линия клеток BC (MDA-MB 468), которая не экспрессирует CXCR4, была использована для изучения того, действует ли пептид Nef-M1 через рецептор CXCR4.Эти клетки временно трансфицировали контрольным вектором pCMV или экспрессирующим вектором pCMV-CXCR4 с использованием реагента для трансфекции TurboFect (Fisher Thermo Scientific, Waltham, MA) в течение указанного времени в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, 1 × 10 клеток ⁵ высевали в шестилуночные планшеты, содержащие среду, и инкубировали в течение ночи. Для каждой лунки 4 мкг ДНК (pCMV или pCMV-CXCR4) смешивали со 100 мкл RPMI-1640. Затем смесь объединяли с раствором 2 мкл реагента для трансфекции TurboFect.После 20-минутной инкубации при комнатной температуре смесь наносили на клетки в конечном объеме 2 мл. Через 24 часа клетки обрабатывали 100 нг / мл пептидов (sNef-M1, Nef-M1 или SDF-1α). Затем клетки культивировали в течение дополнительных 24 часов в 5% CO ₂ при 37 ° C перед анализом.

Гистологическое окрашивание и иммуноцитохимия

Иммуногистохимия выполнялась, как описано ранее [71, 72]. Блоки парафина для опухолей родительских клеток были приготовлены стандартными методами гистопатологии.Вкратце, опухоли собирали, дважды промывали в 1xPBS и фиксировали цинковым фиксатором, не содержащим формалина, в течение 30 минут, затем снова промывали. Эти структуры впоследствии были заключены в парафиновые блоки и нарезаны на срезы толщиной 5 микрон. Депарафинизацию срезов ткани проводили ксилолом с последующей регидратацией с помощью серии растворов этанола (100%, 95%, 80% и 50%). Срезы опухолей оценивали на экспрессию CXCR4 и ангиогенез опухоли, как измеряли с помощью MVD на основе иммуноокрашивания эндотелиального маркера (CD31).MVD определяли с помощью световой микроскопии в областях инвазивной опухоли, содержащих наибольшее количество микрососудов на область. Индивидуальный подсчет микрососудов производился в 200-кратном поле в областях наиболее интенсивной неоваскуляризации опухоли.

Клетки CRC и BC получали путем посева клеток (1 × 10 ⁵) на предметные стекла с поли-D-лизином (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) и последующего прикрепления клеток в течение ночи. Затем клетки промывали 1xPBS и фиксировали цинковым фиксатором, не содержащим формалина (Becton Dickinson), в течение 30 минут и снова промывали.Затем клетки и депарафинизированные срезы ткани подвергали проницаемости с помощью 1xPBS, содержащего 0,1% Triton X-100, в течение 5 минут и промывали 1xPBS. Для иммунофлуоресцентного анализа блокирование проводили для клеток и депарафинированных тканевых срезов 200 мкл раствора для блокировки сыворотки (Zyagen, Сан-Диего, Калифорния) с последующей инкубацией при комнатной температуре в течение 60 минут в увлажненной камере. Срезы образцов инкубировали с 200 мкл (2 мкг / мл) кроличьих поликлональных антител, специфичных к человеку, в течение ночи при 4 ° C при комнатной температуре.Образцы промывали 3 раза 1xPBS по 5 минут каждый, затем инкубировали с 200 мкл раствора биотинилированных вторичных антител (Zyagen) в течение 30 минут при комнатной температуре. После промывания 1xPBS образцы покрывали 200 мкл раствора конъюгата стрептавидин-FITC (Zyagen) и инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре. Образцы снова 3 раза промывали 1xPBS, затем контрастировали 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндолом, раствором дилактата (DAPI) (Zyagen) в течение 2 минут. Образцы промывали 3 раза 1xPBS по 5 мин каждый и покрывали покровным стеклом на предметные стекла, используя антибликовая флуоресцентная монтажная среда (Zyagen).Конфокальные изображения были получены с использованием конфокального лазерного сканирующего микроскопа Olympus FluoView FV1000 (Olympus America), сконфигурированного на полностью автоматизированном инвертированном микроскопе Ix81, с использованием 40-кратного объектива UPLFLN (NA1.3). Отрицательный контроль без первичных антител к CXCR4 использовали для демонстрации его специфичности.

Иммуноферментный анализ

Белок VEGF-A, который был высвобожден в кондиционированную среду клеток HT29 и MDA-MB231, измеряли с использованием коммерчески доступного набора для ELISA VEGF человека (Life Technologies).Клетки (5 × 10 ⁵) высевали в шестилуночные планшеты в 2 мл полной ростовой среды. Двадцать четыре часа спустя клетки голодали по сыворотке в течение 24 часов, а затем подвергали воздействию пептида Nef-M1 с RPM1 1640, содержащим 2% FBS. После 24 часов инкубации в 5% CO ₂ при 37 ° C и 95% увлажненном воздухе, чтобы обеспечить секрецию белка VEGF, кондиционированную среду (CM) собирали. Супернатант осветляли центрифугированием в течение 5 мин, разделяли на аликвоты и хранили при –70 ° C до анализа. CM концентрировали с помощью ультрацентробежных фильтров Amicon (EMD Millipore).Уровни VEGF-A в супернатантах культур определяли с использованием набора для количественного анализа VEGF ELISA Kit (Life Technologies) в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, CM (50 мкл) инкубировали с 50 мкл аналитических разбавителей в течение 2 ч при комнатной температуре в 96-луночном планшете для культивирования ткани, покрытом mAb против VEGF-A. После четырех промывок в каждую лунку добавляли 100 мкл биотинилированного конъюгата Hu VEGF и смесь инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После последующего добавления 100 мкл рабочего раствора стрептавидин-HRP в каждую лунку и 30-минутной инкубации при комнатной температуре.После промывки в каждую лунку добавляли 100 мкл стабилизированного хромагена и инкубировали в течение 30 мин. Оптическую плотность измеряли при 450 нм с использованием микропланшетного ридера Infinite ^® M1000 PRO (Tecon US, Inc., Моррисвилл, Северная Каролина). Для стандартизации одновременно анализировали серийные разведения рекомбинантного человеческого VEGF-A. Все эксперименты проводили в трех повторностях.

Анализ образования пробирок

После размораживания матригеля (EMD Millipore) на льду; 96-луночные планшеты, покрытые 50 мкл матригеля в каждой лунке, инкубировали при 37 ° C в течение 30 минут, чтобы позволить матригелю полимеризоваться.Чтобы изучить влияние пептида Nef-M1 на индуцированное опухолевыми клетками образование трубок HUVEC, кондиционированную среду собирали из обработанных Nef-M1 или sNef-M1 пептидом клеток HT29, MDA-MB231, а также из клеток MDA-MB468, как указано и используется в качестве питательной среды для HUVEC. Всего 1 × 10 ⁴ HUVEC засевали в каждую лунку, содержащую кондиционированную среду. Затем клетки инкубировали в течение 8 ч для образования трубчатых структур. Образование трубок эндотелиальных клеток оценивали с помощью инвертированного фотомикроскопа.Трубчатые структуры количественно оценивали путем ручного подсчета количества капилляров в полях малой мощности.

Вестерн-блот-анализ

Клетки или ткани CRC и BC были подготовлены для вестерн-блоттинга путем инкубации с лизисным раствором (1,0% Nonidet P-40; 50 мМ Tris-HCl; pH 7,5; 20 мМ EDTA буфер) (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) при комнатной температуре в течение 5 мин. Лизаты центрифугировали 20 мин при 12 000 об / мин при 4 ° C. Супернатанты собирали и хранили при –70 ° C. Концентрации белка определяли с помощью набора для анализа Bradford (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).Порции каждого образца (20 мкл) разделяли с помощью SDS-PAGE на готовом геле 4–20% Tris-HCl Criterion (Bio-Rad Laboratories) и электрофоретически переносили на мембраны из поливинилидендифторида (PVDF) (Life Technologies). Мембраны промывали 1x трис-буферным физиологическим раствором (TBS) в течение 5 минут, а затем блокировали 5% обезжиренным молоком в 1x TTBS (1x TBS и 0,1% Tween 20) в течение 1 часа встряхиванием при комнатной температуре. Для определения статуса экспрессии белка в лизатах использовали кроличьи поликлональные антитела против человека.Это осуществляли встряхиванием мембран при 4 ° C в течение ночи, как указано производителем, с последующим нанесением конъюгированных с пероксидазой хрена (HRP) козьих антител против кролика. Полосы белка детектировали с помощью реагента максимальной чувствительности SuperSignal West Femto Substrate Reagent (Fisher Scientific, Pittsburgh PA) с последующим воздействием на систему визуализации Odyssey Fc Dual-Mode (LI-COR, Lincoln, Nebraska). Изображения сканировали в Adobe Photoshop 5.0.2 и денситометрию проводили с использованием программного обеспечения Scion Imaging, Release Beta 3b (Scion Corporation, Frederick, MD).После обнаружения специфических белков блоты удаляли и гибридизовали с поликлональным кроличьим анти-β-актином, затем зондировали конъюгированными с HRP антикроличьими антителами для нормализации.

Статистический анализ

Статистический анализ проводился с использованием стандартного X2-критерия Пирсона, двустороннего критерия Стьюдента t , точного критерия Фишера или однофакторного дисперсионного анализа для сравнения. Различия считались статистически значимыми при p ≤ 0,05.

БЛАГОДАРНОСТЬ И ФИНАНСИРОВАНИЕ

Эта работа была поддержана премией Министерства обороны W81XWH-08–1-0476 и грантом NIH / NCI на разнообразие персонала R21-CA171251.

КОНФЛИКТЫ ИНТЕРЕСОВ

Потенциальных конфликтов интересов нет.

СПРАВОЧНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

1. Американское онкологическое общество. Факты и цифры о раке, 2014 г. Атланта: Американское онкологическое общество; 2014.

2. Харрингтон III В., Бонд В., Хуанг М.Б., Пауэлл М., Лиллард Дж., Манн У., Бамперс Х. Влияние Nef-M1 ВИЧ на рост колоректального рака при опухолевых метастазах в селезенке и печени. Mol Cell Pharmacol. 2009; 1: 85–91.

3. Бамперы HL, Huang MB, Powell M, Grizzle WE, Lillard J, Okoli J, Bond VC.Эффекты ВИЧ-1 Nef, цитотоксического вирусного белка, на рост первичного колоректального рака. Cancer Biol Ther. 2005; 4: 65–69.

4. Бамперы HL, Huang MB, Katkoori VR, Manne U, Bond VC. Nef-M1, антагонист пептида CXCR4, усиливает апоптоз и подавляет рост первичной опухоли и метастазирование при раке молочной железы. J Cancer Ther. 2013; 4: 898–906.

5. Харрис М. От негативного фактора к решающей роли в патогенезе вируса: изменение судьбы неф. J. Gen. Virol. 1969; 77: 2379–2392.

6. Хуанг М.Б., Джин Л.Л., Джеймс КО, Хан М., Пауэлл, доктор медицинских наук, Бонд В.К. Характеристика взаимодействий Nef-CXCR4, важных для индукции апоптоза. J Virol. 2004; 78: 11084–11096.

7. Андре Ф, Ся В, Конфорти Р., Вэй Й, Боуле Т, Томашич Дж, Шпильманн М., Зубир М., Беррада Н., Арриагада Р., Хортобадьи Г. Н., Хунг М.С., Пуштаи Л., Делалог С., Михильс С., Кристофанилли Экспрессия M. CXCR4 при раннем раке груди и риск отдаленного рецидива. Онколог. 2009; 14: 1182–1188.

8.Scala S, Ottaiano A, Ascierto PA, Cavalli M, Simeone E, Giuliano P, Napolitano M, Franco R, Botti G, Castello G. Экспрессия CXCR4 предсказывает плохой прогноз у пациентов со злокачественной меланомой. Clin Cancer Res. 2005; 11: 1835–1841.

9. Стивенсон С.Б., Этешем М., Макмиллан К.М., Валадез Дж. Г., Эджворт М.Л., Прайс Р.Р., Абель Т.В., Мапара К.Ю., Томпсон Р.К. Экспрессия CXCR4 повышена в мультиформной глиобластоме и коррелирует с увеличением интенсивности и степени перитуморальных Т2-взвешенных аномалий сигнала магнитно-резонансной томографии.Нейрохирургия. 2008; 63: 560–569.

10. Hwang JH, Hwang JH, Chung HK, Kim DW, Hwang ES, Suh JM, Kim H, You KH, Kwon OY, Ro HK, Jo DY, Shong M. Экспрессия и функция хемокинового рецептора 4 CXC в анапластике человека клетки рака щитовидной железы. J Clin Endocrinol Metab. 2003; 88: 408–416.

11. Спано JP1, Андре Ф, Морат Л., Сабатье Л., Бесс Б., Комбадьер С., Детер П., Мартин А., Азорин Дж., Валейр Д., Хаят Д., Ле Шевалье Т., Сория Дж. Хемокиновый рецептор CXCR4 и немелкоклеточный рак легкого на ранней стадии: характер экспрессии и корреляция с исходом.Энн Онкол. 2004; 15: 613–617.

12. Wehler T1, Wolfert F, Schimanski CC, Gockel I, Herr W, Biesterfeld S, Seifert JK, Adwan H, Berger MR, Junginger T, Galle PR, Moehler M. Сильная экспрессия хемокинового рецептора CXCR4 коррелятами рака поджелудочной железы с запущенным заболеванием. Oncol Rep. 2006; 16: 1159–1164.

13. Цзян Ю.П., Ву XH, Ши Би, У WX, Инь ГР. Экспрессия хемокина CXCL12 и его рецептора CXCR4 при эпителиальном раке яичников человека: независимый прогностический фактор прогрессирования опухоли.Gynecol Oncol. 2006; 103: 226–233.

14. Акаси Т., Коидзуми К., Цунэяма К., Сайки И., Такано Ю., Фьюз Х. Экспрессия хемокинового рецептора CXCR4 и прогноз у пациентов с метастатическим раком простаты. Cancer Sci. 2008; 99: 539–542.

15. Ким Дж., Такеучи Х., Лам С.Т., Тернер Р.Р., Ван Х.Дж., Куо С., Фошаг Л., Бильчик А.Дж., Хун Д.С. Экспрессия хемокинового рецептора CXCR4 у пациентов с колоректальным раком увеличивает риск рецидива и плохой выживаемости. J Clin Oncol. 2005; 23: 2744–2753.

16.Ян П, Лян С.Х., Хуанг У.Х., Чжан Х.В., Ли XL, Се ЛХ, Ду Ч.В., Чжан ГДж. Аберрантная экспрессия CXCR4 значительно способствует метастазированию и предсказывает плохой клинический исход при раке груди. Curr Mol Med. 2014; 174–84.

17. Сунь Х, Шарбонно С., Вэй Л., Ян В., Чен К., Терек РМ. Таргетная терапия CXCR4 подавляет экспрессию VEGF, ангиогенез и метастазирование хондросаркомы. Mol Cancer Ther. 2013; 12: 1163–1170.

18. Цай Х, Чен З, Пан X, Ся Л., Чен П, Ян И, Ху Х, Чжан Дж, Ли К, Ге Дж, Ю К., Чжуан.Ингибирование ангиогенеза, фиброза и тромбоза тетраметилпиразином: механизмы, влияющие на ось SDF-1 / CXCR4. PLoS ONE. 2014; 9: e88176.

19. Ханахан Д., Вайнберг Р.А. 2000 Признаки рака. Клетка. 2000; 100: 57–70.

20. Ханахан Д., Вайнберг Р.А. 2011 Признаки рака: следующее поколение. Клетка. 2011; 144: 646–74.

21. Weidner N, Semple JP, Welch WR, Folkman J. Корреляция ангиогенеза опухоли и метастазирования при инвазивной карциноме молочной железы. N Engl J Med.1991; 324: 1–8.

22. Росси Д., Злотник А. Биология хемокинов и их рецепторов. Анну Рев Иммунол. 2000; 18: 217–242.

23. Хёбен А., Ландейт Б., Хайли М.С., Вильдьерс Х., Ван Остером А.Т., Де Брёйн Э.А. Фактор роста эндотелия сосудов и ангиогенез. Pharmacol Rev.2004; 56: 549–580.

24. Каллури Р., Вайнберг Р.А. Основы эпителиально-мезенхимального перехода. J Clin Invest. 2009; 119: 1420–1428.

25. Конли-ЛаКомб М.К., Салиганан А., Кандагатла П., Чен Ю.К., Шер М.Л., Чинни С.Р.Активация Akt, опосредованная потерей PTEN, способствует росту опухоли простаты и метастазированию посредством передачи сигналов CXCL12 / CXCR4. Молочный рак. 2013; 12:85.

26. Хирацукаа С., Дудаа Д.Г., Хуанга Й., Гоела С., Сугиямаб Т., Нагасаваб Т., Фукумура Д., Джайна Р.К. Рецептор C-X-C типа 4 способствует метастазированию путем активации митоген-активируемой протеинкиназы p38 в миелоидных дифференцировочных антигенах (Gr-1) -положительных клетках. Proc Natl Acad Sci. 2011; 108: 302–307.

27. Li S, Deng L, Gong L, Bian H, Dai Y, Wang Y. Повышающая регуляция CXCR4, способствующая миграции нейроподобных клеток посредством активации AKT.Неврологические исследования. 2010; 67: 293–9.

28. Yu T, Wu Y, Helman JI, Wen Y, Wang C, Li L. CXCR4 способствует миграции и инвазии плоскоклеточного рака полости рта за счет индукции экспрессии MMP-9 и MMP-13 через сигнальный путь ERK. Mol Cancer Res. 2011; 9: 161–172.

29. Тан Ц.Т., Чу С.Й., Лу Ю.К., Чанг С.К., Лин Б.Р., Ву Х.Х., Лю Х.Л., Ча С.Т., Пракаш Э., Ко Дж.Й., Куо М.Л. CXCL12 / CXCR4 способствует метастазированию плоскоклеточного рака гортани и гипофарингеальной карциномы посредством MMP-13-зависимой инвазии через путь ERK1 / 2 / AP-1.Канцерогенез. 2008; 29: 1519–1527.

30. Бусилло Дж. М., Бенович Дж. Л.. Регуляция передачи сигналов CXCR4. Biochim Biophys Acta. 2007; 1768: 952–63.

31. Иваса С., Янагава Т., Фан Дж., Като Р. Экспрессия CXCR4 и его лиганда SDF-1 при раке желудка кишечного типа связана с метастазами в лимфатические узлы и печень. Anticancer Res. 2009; 29: 4751–4758.

32. Мойер Р.А., Вендт М.К., Йохансен П.А., Тернер Дж. Р., Двинелл М.Б. Активация Rho регулирует стимулируемую хемокинами CXCL12 перестройку и реституцию актина в модельном кишечном эпителии.Lab Invest. 2007; 87: 807–817.

33. Нагасава Т., Хирота С., Татибана К., Такакура Н., Нисикава С., Китамура Ю., Йошида Н., Кикутани Н., Кишимото Т. Дефекты В-клеточного лимфопоэза и миелопоэза костного мозга у мышей, лишенных хемокина CXBSC / P SDF-1. Природа. 1996; 382: 635–638.

34. Zou YR, Kottmann AH, Kuroda M, Taniuchi I, Littman DR. Функция хемокинового рецептора CXCR4 в кроветворении и развитии мозжечка. Природа. 1998; 393: 595–599.

35. Bleul CC, Fuhlbrigge RC, Casasnovas JM, Aiuti A, Springer TA.Высокоэффективный хемоаттрактант лимфоцитов, фактор 1, полученный из стромальных клеток (SDF-1). J Exp Med. 1996; 184: 1101–1109.

36. Блеул С.К., Фарзан М., Чоу Х., Паролин С., Кларк-Льюис И., Содроски Дж., Спрингер Т.А. Хемоаттрактант лимфоцитов SDF-1 является лигандом для LESTR / фузина и блокирует проникновение ВИЧ-1. Природа. 1996; 382: 829–833.

37. Zhang Z, Ni C, Chen W, Wu P, Wang Z, Yin J, Huang J, Qi F. Экспрессия CXCR4 и прогноз рака груди: систематический обзор и метаанализ. BMC Рак.2014; 14:49.

38. An H, Xu L, Zhu Y, Lv T, Liu W, Liu Y, Liu H, Chen L, Xu J, Lin Z. Высокая экспрессия хемокинового рецептора 4 CXC является неблагоприятным прогностическим фактором у пациентов с ясным — клеточная почечно-клеточная карцинома. Br J Рак. 2014; 110: 2261–2268.

39. Гальярди Ф., Нараянан А., Рени М., Франзин А., Мазза Э, Боари Н., Байло М., Зордан П., Мортини П. Роль CXCR4 в биологии высокозлокачественных глиом человека: текущие знания и направления на будущее. GLIA. 2014; 00: 1–9.

40.Leone V, D’Angelo D, Rubio I, de Freitas PM, Federico A, Colamaio M, Pallante P, Medeiros-Neto G, Fusco A. MiR-1 — это опухолевый супрессор в канцерогенезе щитовидной железы, нацеленный на CCND2, CXCR4 и SDF- 1α. J Clin Endocrinol Metab. 2011; 96: E1388 – E1398.

41. Ким Х, Ли Й, Чае И.С., Ким Ч. Корреляция между экспрессией CXCR4 и прогнозом немелкоклеточного рака легкого. Базовая и прикладная патология. 2008; 1: 189–195.

42. Кошиба Т., Хосотани Р., Миямото Ю., Ида Дж., Цудзи С., Накадзима С., Кавагути М., Кобаяси Х., Дои Р., Хори Т., Фуджи Н., Имамура М.Экспрессия производного стромальных клеток фактора 1 и рецепторной системы лиганда CXCR4 при раке поджелудочной железы: возможная роль в прогрессировании опухоли. Clin Cancer Res. 2000; 6: 3530–3535.

43. Поппл А., Даррант Л.Г., Спендлов I, Роллан П., Скотт IV, Дин С., Дж. М. Рэймидж. Хемокин, CXCL12, является независимым предиктором плохой выживаемости при раке яичников. Bri J Cancer. 2012; 106: 1306–1313.

44. Дубровская А., Эллиотт Дж., Саламоне Р.Дж., Телегеев Г.Д., Стаховский А.Е., Щепотин И.Б., Ян Ф., Ван Й., Бушез Л.С., Куларатне С.А., Уотсон Дж., Трассел С., Редди В.А., Чо С.Й., Шульц П.Г.Экспрессия CXCR4 в клетках-предшественниках рака простаты. PLoS ONE. 2012; 7: e31226.

45. Чжан Н.Х., Ли Дж., Ли И, Чжан XT, Ляо В.Т., Чжан Цзи, Ли Р., Луо Р.С. Совместная экспрессия белков CXCR4 и CD133 связана с плохим прогнозом у пациентов с раком толстой кишки II-III стадии. Экспериментальная и лечебная медицина. 2012; 3: 973–982.

46. Salvucci O, Yao L, Villalba S, Sajewicz A, Pittaluga S, Tosato G. Регуляция морфогенеза ветвления эндотелиальных клеток с помощью эндогенного хемокинового фактора-1, производного от стромы.Кровь. 2002; 99: 2703–2711.

47. Ан Дж.Й., Сео К., Вайнберг О.К., Арбер Д.А. Прогностическое значение CXCR4 при остром миелоидном лейкозе. Appl Immunohistochem Mol Morphol. 2013; 21: 79–84.

48. Тамамура Х, Сюй Й, Хаттори Т, Чжан Х, Аракаки Р., Канбара К., Омагари А, Отака А, Ибука Т, Ямамото Н., Накашима Х, Фуджи Н. Низкомолекулярный ингибитор хемокина рецептор CXCR4: сильный пептид против ВИЧ T140. Biochem Biophys Res Commun. 1998; 253: 877–882.

49. Лян З, Ву Т, Лу Х, Ю Икс, Тайчман Р.С., Лау С.К., Ни С., Амбрайт Дж., Шим Х.Подавление метастазов рака груди с помощью селективного синтетического полипептида против CXCR4. Cancer Res. 2004; 64: 4302–4308.

50. Wong D, Kandagatla P, Korz W, Chinni CR. Нацеливание на CXCR4 с помощью CTCE-9908 подавляет метастазирование опухоли простаты. BMC Urology. 2014; 14: 1–7.

51. Cai C, Rodepeter FR, Rossmann A, Teymoortash A, Lee JS, Quint K, Fazio PD, Ocker M, Werner JA, Mandic R. SIVmac239-Nef подавляет экспрессию CXCR4 на клеточной поверхности в опухолевых клетках и ингибирует пролиферация, миграция и ангиогенез.Anticancer Res. 2012; 32: 2759–2768.

52. Фолкман Дж. Каковы доказательства того, что опухоли зависят от ангиогенеза? J Natl Cancer Inst. 1990; 82: 4–6.

53. Фидлер И.Дж., Сингх Р.К., Йонеда Дж., Кумар Р., Сюй Л., Донг З., Биленберг Д.Р., Маккарти М., Эллис Л.М. Критические детерминанты неопластического ангиогенеза. Cancer J. 2000; 6: 225–236.

54. Рибатти Д., Вакка А., Нико Б., Ронкали Л., Даммакко Ф. Постнатальный васкулогенез. Mech Dev. 2001; 100: 157–163.

55. Папетти М., Герман И.М.Механизмы нормального и опухолевого ангиогенеза. Am J Physiol Cell Physiol. 2002; 282: C947–970.

56. Бертолини Ф., Шакед Й., Манкузо П., Кербель Р.С. Многогранная циркулирующая эндотелиальная клетка при раке: к идентификации маркеров и мишеней. Нат Рев Рак. 2006; 6: 835–845.

57. Chiarugi V, Ruggiero M, Magnelli L. Молекулярная полярность в эндотелиальных клетках и ангиогенез, индуцированный опухолью. Oncol Res. 2000; 12: 1–4.

58. Олссон А.К., Димберг А., Крюгер Дж., Клаессон-Уэлш Л.Передача сигналов рецептора VEGF в контроле функции сосудов. Nat Rev Mol Cell Biol. 2006; 7: 359–371.

59. Dufraine J, Funahashi Y, Kitajewski J. Передача сигналов Notch регулирует ангиогенез опухоли с помощью различных механизмов. Онкоген. 2008; 27: 5132–5137.

60. Pages G, Pouyssegur J. Транскрипционная регуляция гена фактора роста эндотелия сосудов — совокупность активирующих факторов. Сердечно-сосудистые исследования. 2005; 65: 564–573.

61. Феррара Н. Роль фактора роста эндотелия сосудов в регуляции физиологического ангиогенеза.Am J Physiol Cell Physiol. 2001; 280: C1358–66.

62. Дворжак Х.Ф., Детмар М., Клаффи К.П., Надь Дж.А., ван де Ватер Л., Сенгер Д.Р. Фактор сосудистой проницаемости / фактор роста эндотелия сосудов: важный медиатор ангиогенеза при злокачественных новообразованиях и воспалениях. Int Arch Allergy Immunol. 1995; 107: 233–5.

63. Cross MJ, Claesson-Welsh L. Функция FGF и VEGF в ангиогенезе: пути передачи сигналов, биологические ответы и терапевтическое ингибирование. Trends Pharmacol Sci. 2001; 22: 201–7.

64. Carmeliet P1, Moons L, Luttun A, Vincenti V, Compernolle V, De Mol M, Wu Y, Bono F, Devy L, Beck H, Scholz D, Acker T, DiPalma T, Dewerchin M, Noel A, Stalmans I, Barra A, Blacher S, VandenDriessche T., Ponten A, Eriksson U, Plate KH, Foidart JM, Schaper W, Charnock-Jones DS, Hicklin DJ, Herbert JM, Collen D, Persico MG. Синергизм между фактором роста эндотелия сосудов и фактором роста плаценты способствует ангиогенезу и экстравазации плазмы при патологических состояниях.Nat Med. 2001; 7: 575–83.

65. Гу П, Ху Б, Гу В., Сюй Л., Ван Д., Хуанг Х. Дж., Кавени В. К., Ченг С. Ю.. Фактор роста B, полученный из тромбоцитов, усиливает ангиогенез глиомы, стимулируя экспрессию фактора роста эндотелия сосудов в эндотелии опухоли и способствуя рекрутированию перицитов. Am J Pathol. 2003; 162: 1083–93.

66. Ван Дж., Ван Дж., Сун Й, Сун В., Нор Дж. Э., Ван Си, Тайчман Р.С. Различные пути передачи сигналов через ось хемокинов SDF-1 / CXCR4 в клеточных линиях рака простаты приводят к измененным паттернам секреции цитокинов и ангиогенеза.Сотовая связь. 2005; 17: 1578–1592.

67. May CD, Sphyris N, Evans KW, Werden SJ, Guo W., Mani SA. Эпителиально-мезенхимальный переход и раковые стволовые клетки: опасно динамичный дуэт в прогрессировании рака груди. Рак молочной железы Res. 2011; 13: 1–10.

68. Li X1, Ma Q, Xu Q, Liu H, Lei J, Duan W, Bhat K, Wang F, Wu E, Wang Z. Передача сигналов SDF-1 / CXCR4 индуцирует инвазию раковых клеток поджелудочной железы и эпителиально-мезенхимальный переход in vitro через неканоническую активацию пути Hedgehog.Cancer Lett. 2012; 322: 169–76.

69. Ван З., Ма Кью, Лю Кью, Ю Х, Чжао Л., Шен С., Яо Дж. Блокада передачи сигналов SDF-1 / CXCR4 ингибирует прогрессирование рака поджелудочной железы in vitro посредством инактивации канонического пути Wnt. Br J Рак. 2008; 99: 1695–1703.

70. Wu Y, Jin M, Xu H, Shimin Z, He S, Wang L, Zhang Y. Клинико-патологическое значение экспрессии HIF-1α, CXCR4 и VEGF при раке толстой кишки. Clin Dev Immunol. 2010; 1–10.

71. Каткоори В.Р., Шанмугам С., Цзя Х, Витта С.П., Стханам М., Калленс Т., Мессиан Л., Чен Д., Чжан Б., Бамперс Х.Л., Самуэль Т., Манне У.Прогностическое значение и профили экспрессии генов мутаций р53 в микросателлитно-стабильных колоректальных аденокарциномах III стадии. PLoS ONE. 2012; 7: e30020.

72. Katkoori VR, Suarez-Cuervo C, Shanmugam C, Jhala NC, Callens T, Messiaen L, Posey J 3rd, Bumpers HL, Meleth S, Grizzle WE, Manne U. Экспрессия Bax является потенциальным прогностическим и прогностическим маркером колоректальный рак. J Гастроинтест Онкол. 2010; 1: 76–89.

Страница не найдена | NECAT

03.06.2021

Вишванатан, Т., Мисра, А., Чан, С. — Х., Ци, С., Дай, Н., Арья, С., Мартинес-Собридо, Л., и Гупта, Ю. К. (2021 г.) Ион металла ориентирует на SARS-CoV -2 мРНК для обеспечения точного 2′-O метилирования его первого нуклеотида. Nat Commun. 12, 3287

29.04.2021

Brosey, CA, Houl, JH, Katsonis, P., Balapiti-Modarage, LPF, Bommagani, S., Arvai, A., Moiani, D., Bacolla, A., Link, T., Warden, LS, Lichtarge , О., Джонс, Д.Е., Ахмед, З., и Тайнер, Дж.A. (2021) Ориентация на структуру макродомена SARS-CoV-2 Nsp3 с учетом структур поли (АДФ-рибозы) гликогидролазы (PARG) человека с помощью ингибиторов. Prog Biophys Mol Biol. 10.1016 / j.pbiomolbio.2021.02.002

08.04.2021

Zhang, C. — H., Stone, EA, Deshmukh, M., Ippolito, JA, Ghahremanpour, MM, Tirado-Rives, J., Spasov, KA, Zhang, S., Takeo, Y., Kudalkar, SN , Лян, З., Айзекс, Ф., Линденбах, Б., Миллер, С.Дж., Андерсон, К.S., and Jorgensen, W. L. (2021) Мощные нековалентные ингибиторы основной протеазы SARS-CoV-2 из молекулярного моделирования лекарственного средства Perampanel на основе расчетов возмущений свободной энергии. ACS Cent Sci. 7, 467-475

08.04.2021

Икетани, С., Фороухар, Ф., Лю, Х., Хонг, С. Юнг, Лин, Ф. — Я., Наир, М.С., Заск, А., Хуанг, Ю., Син, Л., Стоквелл , BR, Chavez, A., and Ho, DD (2021) Ведущие соединения для разработки ингибиторов протеазы SARS-CoV-2 3CL.Nat Commun. 12, 2016

07.04.2021

Черутти, Г., Го, Ю., Чжоу, Т., Горман, Дж., Ли, М., Рапп, М., Реддем, Э.Р., Ю, Дж., Бахна, Ф., Бимела, Дж., Хуанг, Ю., Кацамба, П.С., Лю, Л., Наир, М.С., Рави, Р., Оля, А.С., Ван, П., Чжан, Б., Чуанг, Г. — Й., Хо, Д.Д., Шэн , Z., Kwong, PD, and Shapiro, L. (2021) Мощные нейтрализующие антитела против SARS-CoV-2, направленные против N-концевого домена шипа, нацелены на один суперсайт. Клеточный микроб-хозяин.10.1016 / j.chom.2021.03.005

07.04.2021

Рапп, М., Гуо, Ю., Реддем, Э.Р., Ю, Дж., Лю, Л., Ван, П., Черутти, Г., Кацамба, П., Бимела, Дж. С., Бахна, Ф.А., Маннепалли, С.М., Чжан, Б., Квонг, П.Д., Хуанг, Ю., Хо, Д.Д., Шапиро, Л., и Шенг, З. (2021) Модульная основа для мощной нейтрализации SARS-CoV-2 с помощью распространенного Vh2-2- производный класс антител. Сотовый представитель 10.1016 / j.celrep.2021.108950

06.04.2021

Rostøl, J.T., Xie, W., Kuryavyi, V., Maguin, P., Kao, K., Froom, R., Patel, DJ, and Marraffini, LA (2021) Нуклеаза Card1 обеспечивает защиту при иммунитете CRISPR III типа. . Природа. 590, 624-629

22.03.2021

Тайеб-Флигельман, Э., Ченг, X., Тай, К., Боулер, Дж. Т., Гринер, С., Савая, М. Р., Зайдлер, П. М., Цзян, Ю. Сяо, Лу, Дж., Розенберг, Г. М. Салвински, Л., Абсхарон, Р., Зи, К. — Т., Хоу, К., Ли, Ю., Бойер, Д. Р., Мюррей, К.A., Falcon, G., Anderson, DH, Cascio, D., Saelices, L., Damoiseaux, R., Guo, F., and Eisenberg, DS (2021) Ингибирование образования амилоида нуклеопротеина SARS-CoV -2. bioRxiv. 10.1101 / 2021.03.05.434000

02.03.2021

Yu, CH, Bhattacharya, A., Persaud, M., Taylor, AB, Wang, Z., Bulnes-Ramos, A., Xu, J., Selyutina, A., Martinez-Lopez, A., Cano, К., Демелер Б., Ким Б., Харди С.К., Диас-Грифферо Ф. и Иванов Д.N. (2021) Связывание нуклеиновой кислоты SAMHD1 способствует антиретровирусной активности и усиливается модификацией GpsN. Nat Commun. 12, 731

01.03.2021

Воробьева А.А., Уайт, П., Лян, Б., Хорн, Дж. Э., Бера, А. К., Чоу, С. М., Гербен, С., Маркс, С., Кан, А., Стивинг, А. К., Харви, С. Р., Маркс, Д.К., Г. Хан, Н., Флеминг, К.Г., Высоцкий, В.Х., Броквелл, Д.Д., Тамм, Л.К., Рэдфорд, С.Е., и Бейкер, Д. (2021 г.) Конструирование трансмембранных β-цилиндров de novo.. Наука. 10.1126 / science.abc8182

28.12.2020

Кларк, С.А., Кларк, Л.Е., Пан, Дж., Кошиа, А., Маккей, LGA, Шанкар, С., Джонсон, Р.И., Гриффитс, А., и Абрахам, Дж. (2021) SARS-CoV-2 эволюция в организме хозяина с ослабленным иммунитетом обнаруживает общие механизмы нейтрализации. Клетка. 10.1101 / 2020.11.13.381533

01.12.2020

Линь, Л. Инци, Маккарти, С., Powell, BM, Manurung, Y., Xiang, IM, Dean, WL, Chaires, B., and Yatsunyk, LA (2020) Биофизические и рентгеноструктурные исследования G-квадруплекса (GGGTT) 3GGG в комплексе с N -метилмезопорфирин IX. PLoS One. 15, e0241513

11.11.2020

Лю С., Ли С., Шен Г., Сукумар Н., Крезель А. М. и Ли В. (2020) Структурные основы противодействия каталитическому циклу витамина К для антикоагуляции. Наука. 10.1126 / наука.abc5667

Витамин D является многоуровневым репрессором передачи сигналов Wnt / b-катенина в раковых клетках

% PDF-1.4 % 1 0 объект > / PageMode / UseThumbs / Метаданные 2 0 R / Страницы 3 0 R / OpenAction 4 0 R / StructTreeRoot 5 0 R / Тип / Каталог / Lang (en-US) / OutputIntents [6 0 R] >> эндобдж 7 0 объект / Создатель / Ключевые слова (витамин D; 1a, 25-дигидроксивитамин D3; Wnt; b-катенин; рак толстой кишки; рецептор витамина D) /Режиссер / ModDate (D: 20140514140851 + 02’00 ‘) / Title (Витамин D является многоуровневым репрессором передачи сигналов Wnt / b-катенина в раковых клетках) >> эндобдж 2 0 obj > ручей Microsoft® Office Word 2007, витамин D; 1а, 25-дигидроксивитамин D3; Wnt; b-катенин; рак толстой кишки; Применение рецептора витамина D / pdf

Витамин D является многоуровневым репрессором передачи сигналов Wnt / b-катенина в раковых клетках

Мария Хесус Ларриба, Хосе Мануэль Гонсалес-Санчо, Антонио Барбачано, Нурия Ниель, Джемма Феррер-Майорга, Альберто Муньос

Путь передачи сигналов Wnt / b-катенин аномально активирован при большинстве колоректального рака и в некоторых других неоплазиях.Эта активация инициирует канцерогенез или способствует ему, регулируя экспрессию большого количества генов в опухолевых клетках. Активный метаболит витамина D 1a, 25-дигидроксивитамин D3 (1,25 (OH) 2D3) ингибирует передачу сигналов Wnt / b-катенина с помощью нескольких механизмов в разных точках пути. Кроме того, паракринное действие 1,25 (OH) 2D3 на стромальные клетки также может подавлять этот путь в соседних опухолевых клетках. Здесь мы рассматриваем молекулярные основы различных механизмов, с помощью которых 1,25 (OH) 2D3 противодействует передаче сигналов Wnt / b-catenin, предпочтительно в клетках карциномы толстой кишки человека, и последствия этого ингибирования для фенотипа и скорости пролиферации.Также будет подробно прокомментировано влияние системы витамина D на передачу сигналов Wnt / b-катенина и рост опухоли на животных моделях. Наконец, мы пересматриваем существующие данные о связи между экспрессией рецептора витамина D и статусом витамина D и экспрессией генов и мишеней пути Wnt / b-катенина у онкологических больных.

Путь передачи сигналов Wnt / b-катенин ненормально активируется при большинстве видов рака прямой кишки и в некоторых других неоплазиях. Эта активация инициирует канцерогенез или способствует ему, регулируя экспрессию большого количества генов в опухолевых клетках.Активный метаболит витамина D 1a, 25-дигидроксивитамин D3 (1,25 (OH) 2D3) ингибирует передачу сигналов Wnt / b-катенина с помощью нескольких механизмов в разных точках пути. Кроме того, паракринное действие 1,25 (OH) 2D3 на стромальные клетки также может подавлять этот путь в соседних опухолевых клетках. Здесь мы рассматриваем молекулярные основы различных механизмов, с помощью которых 1,25 (OH) 2D3 противодействует передаче сигналов Wnt / b-catenin, предпочтительно в клетках карциномы толстой кишки человека, и последствия этого ингибирования для фенотипа и скорости пролиферации.Также будет подробно прокомментировано влияние системы витамина D на передачу сигналов Wnt / b-катенина и рост опухоли на животных моделях. Наконец, мы пересматриваем существующие данные о связи между экспрессией рецептора витамина D и статусом витамина D и экспрессией генов и мишеней пути Wnt / b-катенина у онкологических больных.

Microsoft® Office Word 20072013-10-21T08: 04: 53Z2014-05-14T14: 08: 51 + 02: 002014-05-14T14: 08: 51 + 02: 00D52A574C-EC34-4DDF-85E2-F424CE0B7B15uuid: 6a0f86fd-c2e7- 4646-ae4b-da531b1129b91B конечный поток эндобдж 3 0 obj > эндобдж 4 0 obj > эндобдж 5 0 obj > эндобдж 6 0 obj > эндобдж 8 0 объект > / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB / ImageC / ImageI] / XObject> >> / Тип / Страница / Аннотации [50 0 R] >> эндобдж 9 0 объект > / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB / ImageC / ImageI] >> / Тип / Страница >> эндобдж 10 0 obj > / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB / ImageC / ImageI] >> / Тип / Страница >> эндобдж 11 0 объект > / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB / ImageC / ImageI] >> / Тип / Страница >> эндобдж 12 0 объект > / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB / ImageC / ImageI] >> / Тип / Страница >> эндобдж 13 0 объект > / Шрифт> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB / ImageC / ImageI] >> / Тип / Страница >> эндобдж 14 0 объект > / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB / ImageC / ImageI] >> / Тип / Страница >> эндобдж 15 0 объект > / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB / ImageC / ImageI] >> / Тип / Страница >> эндобдж 16 0 объект > / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB / ImageC / ImageI] >> / Тип / Страница >> эндобдж 17 0 объект > / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB / ImageC / ImageI] >> / Тип / Страница >> эндобдж 18 0 объект > / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB / ImageC / ImageI] >> / Тип / Страница >> эндобдж 19 0 объект > / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB / ImageC / ImageI] >> / Тип / Страница >> эндобдж 20 0 объект > / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB / ImageC / ImageI] >> / Тип / Страница >> эндобдж 21 0 объект > / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB / ImageC / ImageI] >> / Тип / Страница >> эндобдж 22 0 объект > / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB / ImageC / ImageI] >> / Тип / Страница >> эндобдж 23 0 объект > / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB / ImageC / ImageI] >> / Тип / Страница >> эндобдж 24 0 объект > / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB / ImageC / ImageI] >> / Тип / Страница >> эндобдж 25 0 объект > / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB / ImageC / ImageI] >> / Тип / Страница >> эндобдж 26 0 объект > / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB / ImageC / ImageI] >> / Тип / Страница >> эндобдж 27 0 объект > эндобдж 28 0 объект > эндобдж 29 0 объект > ручей Кирилл

Отзывы владельцев об автомобилях Geely CK (Otaka) (Джили ЦК Отака) на Авто.ру

Всё о Geely CK (Otaka)

Отзывы владельцев Geely Otaka (Джили Отака) с фото, плюсы и минусы, достоинства и недостатки

Коробка передач

Объем двигателя, л

Отзыв Geely Otaka (Джили Отака) 2007 г. Часть 4

полный каталог моделей, характеристики, отзывы на все автомобили Geely (Джили)

Джили

Автомобили Geely

Atlas

Coolray

Emgrand

Emgrand 7

Emgrand EC7

Emgrand GS

Emgrand GT

Emgrand X7

GC6

GX7

MK

MK Cross

Otaka

Preface

SX11

Tugella

Vision

О Geely

Все модели Geely

geely otaka — Авторевю

Китайские автомобили — Страница не найдена

У нас нет такой страницы :((

История марки Geely — CARobka.ru

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Что сохраняется в файле cookie?

SEC.gov | Превышен порог скорости запросов

Дополнительная информация

Политика безопасности в Интернете

Дельтакоронавирус свиней проникает в клетки двумя путями: один, опосредованный протеазой, на поверхности клетки, а другой — катепсинами в эндосоме

Рекомендуемые статьи

Цитирующие статьи

Nef-M1, пептидный антагонист CXCR4, ингибирует ангиогенез опухоли и эпителиально-мезенхимальный переход при раке толстой кишки и молочной железы

ВВЕДЕНИЕ

РЕЗУЛЬТАТЫ

CXCR4 экспрессируется в опухолевых ксенотрансплантатах и ​​родительских клетках рака толстой кишки человека

CXCR4 прогрессивно экспрессируется при запущенном заболевании

Пептид Nef-M1 индуцирует апоптоз

Пептид Nef-M1 ингибирует ангиогенез опухоли

Nef-M1 снижает экспрессию VEGF-A в CRC и BC

Пептид Nef-M1 ингибирует образование канальцев эндотелиальных клеток

Пептид Nef-M1 ингибирует процесс EMT

Пептид Nef-M1 ингибирует опухолевый ангиогенез и процесс EMT в клетках BC посредством CXCR4

ОБСУЖДЕНИЕ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Пептиды и антитела

3

Животные и инъекции пептида Nef-M1

Животные и рост опухоли

Хирургические процедуры

Имплантация опухоли

Обработка Nef M1

Модель метастаза

TUNEL assay

Культуры клеток, трансфекции и обработка

Гистологическое окрашивание и иммуноцитохимия

Иммуноферментный анализ

Анализ образования пробирок

Вестерн-блот-анализ

Статистический анализ

БЛАГОДАРНОСТЬ И ФИНАНСИРОВАНИЕ

КОНФЛИКТЫ ИНТЕРЕСОВ

СПРАВОЧНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Страница не найдена | NECAT

03.06.2021

29.04.2021

08.04.2021

08.04.2021

07.04.2021

07.04.2021

CXCR4 экспрессируется в опухолевых ксенотрансплантатах и родительских клетках рака толстой кишки человека