Лада 21218: Ошибка 404. Страница не найдена — Объявления на сайте Авито

GPVN.RU / Автомобили ВАЗ / Нива / ВАЗ 212182 Форс

Фото ВАЗ 212182 Форс
Вопросы бронирования «Нивы» были отработаны на первых подобных машинах, имеющих приставку «Б», созданных еще из ВАЗ 2121. Такие сегодня уже не выпускаются. Бронированный вариант ВАЗ 21218, в первую очередь предназначен для обслуживания банков и инкассаторов. Броня и специальные многослойные стекла способны защитить водителя и пассажиров машины от пуль автомата Калашникова калибра 5,45 и 7,62 мм. У боковых дверей усиленные петли, дополнительные запоры и бойницы для ведения ответной стрельбы. В обязательный комплект поставки входят: автоматическая система пожаротушения, установленная в моторном отсеке; взрывопожаробезопасный топливный бак; дополнительная аккумуляторная батарея; кондиционер; дистанционный привод замка правой двери с места водителя. В качестве дополнительного оборудования предлагается бронированный пол, светосигнальные маячки и т.п.
Характеристика ВАЗ 212182 Форс
Автомобиль ВАЗ	212182 Форс
Кузов
Тип кузова	универсал
Число мест	3
Число дверей	3
Габариты
Длина, мм	4040
Ширина, мм	1680
Высота, мм	1750
Колесная база, мм	2500
Колея колес спереди, мм	1430
Колея колес сзади, мм	1400
Дорожный просвет, мм	288
Шины	175/80 R16
Снаряженная масса, кг	1700
Полная масса, кг	2100
Полезная нагрузка, кг	400
Объем багажника, л	265
Объем топливного бака, л	42
Двигатель
Модель двигателя	21213
Тип двигателя	L4
Объем двигателя, см³	1690
Мощность, л. с./об.мин	76/5200
Крутящий момент, Н·м/об.мин	123/3400
Наддув	—
Клапанов на цилиндр	2
Расположение клапанов и распределительного вала	верхнеклапанный с верхним расположением распределительного вала
Компоновка двигателя	спереди, продольно
Система питания	карбюратор
Скорость
Максимальная скорость, км/ч	132
Разгон до 100 км/ч, с	25
Топливо
Марка топлива	бензин 95
Расход, л/100 км	14
Привод
Тип привода	постоянный на все колеса
КПП
Механическая	5
Автоматическая	—
Подвеска
Передняя	независимая
Задняя	пятиштанговая
Тормоза
Передние	дисковые
Задние	барабанные

Автомобиль Lada (ВАЗ) 21218 (4×4) 1.

Кузов Тип: Внедорожник Количество дверей: 3 Количество мест: 5 Начало выпуска: 1996 Окончание выпуска: 2011 Страна производитель: Россия Двигатель Рабочий объем, см³: 1690 Число цилиндров: 4 Расположение цилиндров: Рядный Количество клапанов на цилиндр: 2 Система питания: Карбюратор Наличие наддува: Нет Мощность, л. с. при об/мин: 79 при 5200 Крутящий момент, Н•м при об/мин: 127 при 3200 Рулевое управление Тип: Шестерня-рейка Усилитель руля: Гидравлический Динамические характеристики Разгон с места до 100 км/ч, с: 19,0 Максимальная скорость, км/ч: 137 Топливо, токсичность Средний условный расход топлива, л/100 км: 7,5 Город, л/100 км: 10,2 Шоссе, л/100 км: 5,8 Тип и марка топлива: АИ-95 Соответствует ограничениям токсичности выхлопа:

Габариты, масса, объёмы Длина, мм: 4040 Ширина, мм: 1680 Высота, мм: 1750 Колёсная база: 2500 Колея передних колёс: 1430 Колея задних колёс: 1400 Клиренс: 228 Диаметр разворота, м: Снаряженная масса, кг: 1270 Допустимая полная масса, кг: 1720 Объем багажника мин. /макс.; л: 265/980 Объем топливного бака, л: 42 Трансмиссия Тип привода: Полный постоянный Тип коробки: МКПП Ходовая часть Передняя подвеска: Винтовая пружина Задняя подвеска: Винтовая пружина Тормоза передние: Дисковые Тормоза задние: Барабанные Шины, стандартная комплектация: 175/80 R16

ВАЗ 212182 «VIP»

Этот бронированный вариант ВАЗ 21218 предназначен для перевозок VIP-пассажиров в условиях повышенного комфорта по любых типам дорог с повышеными мерами безопасности и в сопровождении охраны.

Броня и специальные многослойные стекла способны защитить водителя и пассажиров машины от пуль автомата Калашникова калибра 5,45 и 7,62 мм. У боковых дверей усиленные петли, дополнительные запоры и бойницы для ведения ответной стрельбы.

В обязательный комплект поставки входят: автоматическая система пожаротушения, установленная в моторном отсеке; взрывопожаробезопасный топливный бак; дополнительная аккумуляторная батарея; кондиционер; дистанционный привод замка правой двери с места водителя.

В качестве дополнительного оборудования предлагается бронированный пол, светосигнальные маячки и т. п.

	212182
Исполнения:	стандарт	спецзаказ
Тип кузова	универсал
Мест	5
Дверей	3
Габаритные размеры, мм:
длина	4040
ширина без зеркал	1680
высота	1750
Масса собственная	1700
Полезная нагрузка	400
Колесная база	2500
Колея спереди	1430
Колея сзади	1400
Ведущие колеса	Полный привод
Дорожный просвет до поддона картера двиг.	319
Дорожный просвет до балки заднего моста	220
Дорожный просвет до балки пер. подвески	288
Двигатель	21213
рабочий объем, куб. см.	1689
макс. мощность, кВт (при об/мин)	56,1 (5200)
макс. мощность, л. с.	76,3
макс. крут. момент, Н.м (при об/мин)	125,3 (3000)
система питания	карбюратор
КП
Число ступеней коробки передач	5
Передаточные числа коробки передач
I	3,67
II	2,1
III	1,36
IV	1
V	0,82
Задний ход	3,53
Передаточные числа раздаточной коробки
Высшая передача	1,2
Низшая передача	2,135
Передаточное число главной передачи	3,9
Скорость максимальная, км/ч	125
Расход топлива, л/100 км:
расход топлива при 90 км/ч	11
расход топлива в городском цикле	14
Емкость топливного бака	42
Тормоза передние	Дисковые
Тормоза задние	Барабанные
Привод стояночного тормоза	Тросовый
Привод сцепления	Гидравлический
Подвеска передняя	Независимая
Подвеска задняя	Пятиштанговая
Рулевое управление	Червяк-ролик
Гидроусилитель руля	—	+
Радиус поворота наименьший	6,0
Шины	185/75R16
Рулевое колесо	21213
Коврики	резиновые
Бамперы	алюминиевые
Очиститель заднего стекла	+	+
Диски литые 16″	+	+
Кондиционер	+	+
Система автоматич. пожаротушения	+	+
Дистанционный привод замка правой двери	+	+
Передний отбойник с бронерешеткой	—	+
Взрывобезопасный топливный бак	+	+
Дополнительный люк в задней стенке	—	+
подставка под АКМ	—	+

Главный исследователь Myong Lab

Сейн-офф превращается в невидимый ТВ-финал: балтиморцы волнуются, поскольку электрические и кабельные сбои прерывают финальный «Сайнфельд».’

Тысячи жителей Балтимора, которые просто устраивались, чтобы посмотреть грандиозный финал «Сайнфельда» прошлой ночью, в конечном итоге с недоверием и яростью направили свои кликеры на пустые телеэкраны, когда в городе произошло отключение электричества в самый неподходящий момент.

Около 17 000 потребителей коммунальных услуг на севере, северо-востоке и северо-западе Балтимора отключили электричество около 18:00. — затем снова потерял его после того, как телевизоры ожили для 20-минутного трепа примерно с 8:20 p.м. до 8:40 вечера

Специальный 75-минутный «Сайнфельд» начался в 20:45.

Неизвестное количество жителей Балтимора сохранили электроэнергию, но лишились кабельного телевидения и, как следствие, своих планов смотреть получившую широкую огласку программу.

«Я обезумела», — простонала 44-летняя Дениз Кэролан из Чарльз-Виллидж. «Это то, о чем все думали сегодня вечером: прийти домой, посмотреть« Сайнфельд »и расслабиться.

« Все будут говорить об этом завтра, и я не хочу слышать все изюминки.

Тони Рид, житель Вест-Лейк-авеню, сказал после того, как его телеграмма отключилась во второй раз: «Я пытался позвонить в TCI не менее 12 раз, и номер был занят. Я стою здесь и смотрю на черный экран ».

Телефонные линии к TCI Communications of Baltimore, городскому кабельному провайдеру, вчера вечером оставались затопленными, и с представителем не удалось связаться.

сообщила, что ее система сообщений забита звонками и больше никаких жалоб принимать не будет.

Кэтлин Нолан, пресс-секретарь Baltimore Gas and Electric Co., сообщила, что в службу неисправностей BGE поступили звонки по поводу отключения электроэнергии.

Главная претензия: нет «Сайнфельда».

«Коммутатор в наших офисах в центре города зажег что-то ужасное, — сказала она.

Нолан не знал, почему у некоторых жителей не было электричества, а у других остался только кабель, но осталось электричество. Она сказала, что бригады работают над устранением проблемы, которая возникла в результате отказа трех фидерных линий на двух подстанциях, на проспекте Либерти Хайтс в Форест-парке на северо-западе Балтимора и на Центральной улице в центре города.

Затронутые районы города включали несколько основных районов, где можно было наблюдать за Сайнфелдом: Чарльз-Виллидж, Гилфорд, Роланд-Парк и Гамильтон. Отключения были спорадическими — многие дома в почтовом индексе 21218 в Северном Балтиморе обесточились, но Университет Джона Хопкинса, который имеет этот почтовый индекс, не пострадал.

Некоторые жители позвонили друзьям и родственникам и попросили их записать шоу на пленку, но другие решили, что «смотреть телевизор обязательно» означает именно это.

Кевин Макгоуэн, 40 лет, школьный учитель, выбежал из своего дома в ближайший ресторан Rootie Kazootie на углу улицы Чарльз и 27-й улицы, который не пострадал от отключения электричества.

Тем не менее, он посетовал: «Это катастрофа».

Другие посетители сжимали фонарики, готовясь к повторному входу в темные дома, и сочувствовали друг другу, глядя в несколько телевизоров ресторана.

Другим предприятиям повезло меньше.

Официантка Энн Крейг из закрытого паба Charles Village в квартале 3100 на улице Сент-Пол сказала, что люди звонили весь день, чтобы убедиться, что в пабе будет показывать «Сайнфельд», и ожидалось большое скопление людей.

«Мы потеряли [власть] в середине Суперкубка год или два назад», — с сожалением добавил Крейг.

Хотя ожидалось, что количество просмотров вчерашнего «Сайнфелда» не превысит последний эпизод «M * A * S * H» в 1983 году, опрос Eisner & Associates Inc. из Балтимора предсказал, что 44 процента всех взрослых по всей стране — или около 110 миллионов зрителей — настроились бы.

Нил Гэбби был среди тех, кого не позабавило, узнав, что программа, разрекламированная как «шоу ни о чем», действительно была ни о чем прошлой ночью.

«Это« Кто стрелял в Дж.Р.? »Этого поколения? «сказал 27-летний учитель в Gilman School.

«Мы с женой сидим здесь и читаем в общей комнате, но мы все еще можем слышать жужжание телевизора на всякий случай. Но я теряю надежду. Как наблюдатель с первого шоу, я невероятно раздражен. »

Для некоторых сага о сбоях закончилась так, как могла бы закончиться, если бы это был всего лишь очередной эпизод «Сайнфельда».

Телевизор Кэролан был в числе тех, кто вовремя включил титры.

Большинство клиентов вернули электричество около 21:40, сказал Нолан. Около 3500 других все еще были отключены в 11 часов вечера, но ожидалось, что электричество будет восстановлено к полуночи — через два часа после выхода «Сайнфельда».

Дата публикации: 15.05.98

Ацетазоламид — C4H6N4O3S2 — Bertin Bioreagent

Cayman Chemical — помочь сделать исследования возможными, предоставив ученым во всем мире базовые исследовательские инструменты, необходимые для улучшения здоровья людей и животных.Нашим максимальным обязательством перед исследователями в области здравоохранения является предложение продуктов высочайшего качества по доступной ценовой политике.

Наши ученые являются экспертами в синтезе, очистке и характеристике биохимических веществ, от небольших гетероциклов, подобных лекарствам, до сложных биолипидов, жирных кислот и многих других. Мы также обладаем высокой квалификацией во всех аспектах анализа и разработки антител, экспрессии белков, кристаллизации и определения структуры.

За последние тридцать лет на Каймановых островах накопилась обширная база знаний в области биохимии липидов, включая исследования, касающиеся каскада арахидоновой кислоты, инозитолфосфатов и каннабиноидов.Эти знания позволили производить реагенты исключительного качества для лечения рака, окислительного повреждения, эпигенетики, нейробиологии, воспалений, метаболизма и многих дополнительных направлений исследований.

Наши химики-органики и аналитики специализируются на быстрой разработке производственных процессов и аналитических методов для осуществления клинического и коммерческого производства GMP-API. В настоящее время проводятся доклинические исследования лекарств в областях восстановления и восстановления костей, мышечной дистрофии, онкологии и воспалений.Отдельная группа ученых с докторской степенью занимается предоставлением услуг по обнаружению и профилированию эпигенетических целей. Мы можем нанять наших опытных химиков для выполнения полного анализа проб аналитов, измеряемых в большинстве наших анализов. Мы также предлагаем широкий спектр аналитических услуг с использованием ЖХ-МС / МС, ВЭЖХ, ГХ и многих других методов.

Аккредитация
ISO / IEC 17025: 2005
ISO Guide 34: 2009

Каймановы острова — лидер в области новых наркотиков, вызывающих злоупотребление, предоставляя высокочистые контролируемые вещества Списка I-V лабораториям, имеющим федеральные лицензии, и квалифицированным академическим исследовательским институтам для проведения судебно-медицинских анализов.Мы сертифицированы Службой аккредитации ACLASS с двойной аккредитацией по ISO / IEC 17025: 2005 и ISO Guide 34: 2009.

Дифференциальные эффекты рибосомных белков и ионов Mg2 + на конформационный переключатель во время сборки 5′-домена 30S рибосомы

1. Санджая К. Абейсиригунавардена1 и
2. Сара А. Вудсон

1. T.C. Дженкинс, Департамент биофизики, Университет Джона Хопкинса, Балтимор, Мэриленд 21218, США

1. Автор, ответственный за переписку: swoodson {at} jhu.edu

• №1 Нынешний адрес: Кафедра химии и биохимии, Государственный университет Кента, Кент, Огайо 44242, США

Абстрактные

Рибосомный белок S4 является ядром сборки 5 ‘и центральных доменов 30S рибосомы, что имеет решающее значение для выживания клеток. Белок S4 изменяет структуру своего сайта связывания 16S рРНК, проходя через ненативный промежуточный комплекс перед образованием нативные контакты S4-рРНК.Ансамбль FRET был использован для измерения термодинамической стабильности ненативных и природных комплексов S4. в присутствии ионов Mg ²⁺ и других 5′-доменных белков. Равновесное титрование Cy3-меченной 5′-доменной РНК с Cy5-меченным белком S4 показало что ионы Mg ²⁺ предпочтительно стабилизируют нативный комплекс S4-рРНК. Напротив, рибосомные белки S20 и S16 действуют путем дестабилизации ненативный комплекс S4-рРНК.Полный кооперативный переход на собственный комплекс требует S4, S16 и S20 и достигается в меньшей степени S4 и S16. Полученная термодинамическая модель сборки тела 30S иллюстрирует, как рибосомные белки выборочно изменяют равновесие между альтернативными конформациями рРНК, увеличивая кооперативность сворачивания рРНК сверх того, что может быть достигнуто одними ионами Mg ²⁺ .

• Поступила 05.02.2015.
• Принята к печати 4 августа 2015 г.

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie.Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie.Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Распределение гликозилфосфатидилинозитол-заякоренного белка на апикальной поверхности клеток MDCK, исследованных с разрешением

Мембранные микродомены («липидные рафты»), обогащенные гликозилфосфатидилинозитолом (GPI) белками, гликосфинголипидами и холестерином, вовлечены в события, начиная от переноса через мембрану и заканчивая передачей сигнала. Хотя существуют биохимические доказательства наличия таких микродоменов мембран, они не были визуализированы с помощью световой или электронной микроскопии.Чтобы исследовать микродомены, обогащенные GPI-заякоренными белками в интактных клеточных мембранах, мы использовали новую форму цифровой микроскопии, визуализацию флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET), которая расширяет разрешение флуоресцентной микроскопии до молекулярного уровня (<100 Å). Мы обнаружили значительный перенос энергии между меченными донорами и акцепторами антителами против GPI-заякоренного протеина 5'-нуклеотидазы (5'-NT) на апикальной мембране клеток MDCK. Эффективность передачи энергии сильно коррелировала с поверхностной плотностью меченного акцептором антитела.Данные FRET соответствовали теоретическим предсказаниям для двумерного FRET между случайно распределенными молекулами и не соответствовали модели, в которой 5'-NT является конститутивно сгруппированной. Хотя мы не можем полностью исключить возможность того, что некоторые 5'-NT находятся в кластерах, данные подразумевают, что большинство молекул 5'-NT случайным образом распределяются по апикальной поверхности клеток MDCK. Эти находки ограничивают существующие модели липидных рафтов и мембранную организацию GPI-заякоренных белков.

Гликозилфосфатидилинозит (GPI) ¹ -заякоренные белки прикреплены к бислою мембраны с помощью комплексного якоря, состоящего из фосфоэтаноламина, гликанов и липида фосфатидилинозитола (Low, 1989).В биологических мембранах GPI-заякоренные белки, как полагают, находятся в микродоменах мембран (также известных как «рафты» или нерастворимые в детергенте, обогащенные гликолипидом комплексы), которые обогащены гликосфинголипидами (GSL) и холестерином (обзоры см. В Simons and van Meer , 1988; Лисанти и Родригес-Булан, 1990; Саймонс и Вандингер-Несс, 1990; Хардер и Саймонс, 1997; Саймонс и Иконен, 1997). Было высказано предположение, что эти микродомены важны для апикальной сортировки GPI-заякоренных белков в поляризованных клетках (Brown et al., 1989; Лисанти и др., 1989; Lisanti and Rodriguez-Boulan, 1990), а также для внутриклеточной передачи сигналов после перекрестного связывания GPI-заякоренных и трансмембранных белков (Lisanti et al., 1994; Field et al., 1997; Harder and Simons, 1997; Simons and Ikonen, 1997). .

Доказательства мембранных микродоменов получены в биохимических экспериментах, в которых дифференциальная растворимость мембранных белков и липидов в детергенте используется в качестве критерия для определения микродомена (Stefanova et al., 1991; Браун и Роза, 1992; Sargiacomo et al., 1993; Arreaza et al., 1994). Однако другие исследования показывают, что белки и липиды, обладающие общим свойством нерастворимости детергентов, не обязательно связаны в интактных клеточных мембранах (Kurzchalia et al., 1995; Mayor and Maxfield, 1995; Schnitzer et al., 1995, 1996; Hannan and Edidin). , 1996). Кроме того, электронная и флуоресцентная микроскопия интактных клеток обычно не обнаруживают мембранные микродомены, обогащенные GPI-заякоренными белками. В ранних работах, визуализирующих кластеры GPI-заякоренных белков, использовались вторичные антитела (Rothberg et al., 1990), которые сами по себе могли вызывать перекрестное связывание (Mayor et al., 1994; Fujimoto, 1996). Исследования также показывают, что в устойчивом состоянии, в отсутствие перекрестного связывания, GPI-заякоренные белки случайным образом распределяются в плазматической мембране (Parton et al., 1994; Rijnboutt et al., 1996). Этот результат согласуется с работой нашей лаборатории с использованием биофизического метода флуоресцентной микроскопии с резонансным переносом энергии (FRET). Хотя FRET может обнаруживать близость молекул, мы не нашли доказательств наличия FRET между мечеными GPI-заякоренными белками в стационарных условиях (Hannan et al., 1993). Недавно Хардер и Саймонс (1997) попытались разрешить эти несопоставимые результаты, предположив, что нерастворимые домены, выделенные экстракцией детергентом, представляют собой слитые микродомены неизвестного размера, морфологии и состава. С этой точки зрения, методы, основанные на микроскопии, не могут обнаружить микродомены в неповрежденных клеточных мембранах, потому что домены представляют собой небольшие динамические структуры, которые находятся ниже предела разрешения микроскопа.

Продолжающееся несоответствие между очевидным обогащением GPI-заякоренных белков мембранными микродоменами, о котором сообщают биохимические методы, и случайным стационарным распределением этих белков, полученным с помощью микроскопии, привело нас к использованию нового метода, визуализации FRET, для критического пересмотра устойчивого -состояние мембранной организации GPI-заякоренного белка.Визуализация FRET сочетает в себе цифровую иммунофлуоресцентную микроскопию с FRET, феноменом, который сообщает о близости между молекулами в масштабе 1–10 нм. Таким образом, визуализация FRET увеличивает разрешение обычной иммунофлуоресцентной микроскопии до молекулярного уровня и, таким образом, позволяет количественно оценить молекулярную близость в интактных клеточных мембранах (Herman, 1989; Jovin and Arndt-Jovin, 1989, a , b ; Tsien et al. ., 1993; Uster, 1993; Selvin, 1995). Визуализация FRET отображает передачу энергии между интересующими молекулами по отдельности, что является значительным прогрессом по сравнению с нашим предыдущим микроскопическим методом FRET, который измерял средний FRET для популяции клеток (Hannan et al., 1993). Сравнивая экспериментальные значения FRET с теоретическими предсказаниями для случайно распределенных молекул, визуализирующие измерения FRET можно использовать для вывода об организации молекул — сгруппированных или случайно распределенных — в клеточных мембранах. Следовательно, визуализация FRET должна быть способна обнаруживать обогащение GPI-заякоренных белков в мембранных микродоменах, слишком малых для разрешения световой микроскопии, пока GPI-заякоренные белки в домене находятся в пределах <100 Å друг от друга.

В этом исследовании мы оцениваем стационарное распределение GPI-заякоренного белка, 5′-нуклеотидазы (5′-NT), в апикальной плазматической мембране трансфицированных клеток MDCK.Нерастворимые в детергенте комплексы, содержащие GPI-заякоренные белки и GSL, были впервые идентифицированы в клетках MDCK (Brown and Rose, 1992), и эта клеточная линия широко использовалась в исследованиях сортировки белков (Simons and Ikonen, 1997). 5′-NT (CD73) представляет собой эктофермент массой 70 кДа, который катализирует гидролиз 5′-АМФ до аденозина (см. Обзор Zimmermann, 1992). 5′-NT обогащен нерастворимыми в детергенте комплексами в нескольких различных клеточных системах (Mescher et al., 1981; Schnitzer et al., 1995; Strohmeier et al., 1997), иногда обнаруживается кластерами с помощью иммуноэлектронной микроскопии (Howell et al., 1987), и при перекрестном связывании антител может запускать внутриклеточные сигнальные события в некоторых типах клеток (Airas et al., 1997; Resta and Thompson, 1997) .

Чтобы увидеть, распределяется ли 5′-NT случайным образом на апикальной мембране клеток MDCK, или если он обогащен мембранными микродоменами, мы объединили визуализацию FRET с теорией, ранее разработанной для двумерного FRET.FRET между мечеными молекулами 5′-NT должен быть обнаружен независимо от того, сгруппированы ли они в микродомены мембраны, поскольку FRET может также возникать между случайно распределенными молекулами, имеющими высокую поверхностную плотность. Однако теория FRET между донорами и акцепторами в мембране позволяет нам различать сгруппированные молекулы 5′-NT, случайно распределенные молекулы 5′-NT и их смеси. Как и ожидалось, мы обнаружили FRET в стационарных условиях. Взаимосвязь между степенью FRET, поверхностной концентрацией 5′-NT и пропорциями донорных и акцепторных меток показывает, что большинство, если не все 5′-NT-молекулы распределены случайным образом и не группируются или не ограничиваются липидными рафтами.

Полноразмерная кДНК 5′-NT из печени крысы (клон pcNT341) была щедрым подарком д-ра Я. Икехары (Misumi et al., 1990). pcNT341 был вставлен в сайт EcoRI pCB6 (Brewer, 1994), модифицированный так, чтобы он содержал часть сайта мультиклонирования Bluescript. Клетки MDCK (тип II) трансфицировали с использованием метода осаждения фосфатом кальция (Weisz et al., 1992) и отбирали в среде, содержащей 500 мкг / мл G418 (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD).Положительные клоны выделяли с использованием колец для клонирования и проверяли с помощью непрямой иммунофлуоресцентной микроскопии. Затем один из положительных клонов субклонировали путем сортировки клеток с последующим посевом при предельном разведении нетрансфицированными клетками.

После клонирования клетки поддерживали в DME (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (INTERGEN Co., Purchase, NY), заменимых аминокислот (GIBCO BRL) и 300 мкг / мл G418.Семена размножения пассировали при разведении 1:50 каждые 4–6 дней. Клетки для экспериментов высевали на стерильные покровные стекла в разведении 1: 5 (~ 1 × 10 ⁶ клеток / 10-см планшет, шесть покровных стекол / планшет, переносили в шестилуночные чашки на следующий день) и выращивали до слияния (2 –5 г). Для экспериментов по биотинилированию клетки высевали на фильтры (вставки для культур клеток Falcon HD, шестилуночный формат, размер пор 0,4 мкм; Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ) при плотности ~ 1 × 10 ⁶ клеток.Там, где указано, экспрессия 5′-NT усиливалась инкубацией в течение ночи в среде, содержащей 10 мМ бутирата натрия, перед экспериментом.

Клетки на покровных стеклах метили в течение 15 мин при 4 ° C с помощью 100 мкл смеси антител, меченных донором (Cy3) и акцептором (Cy5). Во всех экспериментах антитела разводили в PBS с добавлением 0,9 мМ CaCl ₂ , 0,52 мМ MgCl ₂ и 0.16 мМ MgSO ₄ (PBS ⁺⁺ ), содержащий 1% БСА. Клетки дважды промывали в течение 5 мин в PBS ⁺⁺ при 4 ° C. Затем клетки фиксировали в течение 30 минут при комнатной температуре в 4% формальдегиде в PBS ⁺⁺ , свежеприготовленном из 16% раствора формальдегида (Electron Microscopy Sciences, Форт Вашингтон, Пенсильвания). Наконец, покровные стекла помещали на предметные стекла в PBS, используя куски ленты толщиной 50 мкм, чтобы удерживать покровные стекла от предметного стекла, а затем закрывали лаком для ногтей.Обратите внимание, что мы решили зафиксировать клетки перед измерениями под микроскопом, чтобы предотвратить потенциальную реорганизацию белков в ходе экспериментов. К этому моменту в экспериментах, в которых клетки метили конъюгированными с флуорофором первичными антителами (IgG), а затем переводили на 37 ° C на 30 мин, метка выглядела более «пятнистой», чем в контроле, который фиксировали немедленно.

Если не указано иное, концентрацию Cy3-конъюгированного антитела поддерживали постоянной на уровне 50 мкг / мл в каждой смеси, и Cy5-конъюгированное антитело добавляли для получения указанного молярного отношения донора к акцептору (D: A).В контрольных экспериментах концентрация насыщающих антител была определена как ~ 200 мкг / мл. Таким образом, в экспериментах FRET общая концентрация антител варьировалась от субнасыщающей до насыщающей. Экспериментально измеренное отношение флуоресценции донора к акцептору было прямо пропорционально D: A, нанесенному на клетки.

В экспериментах по измерению FRET между первичными и вторичными антителами клетки метили 50 мкг / мл Cy3-5NT4-2 IgG, как указано выше, дважды промывали PBS ⁺⁺ в течение 5 минут при 4 ° C, инкубировали в течение 15 минут при 4 ° C с 5 или 50 мкг / мл вторичного антитела, меченного Cy5 (ослиные антимышиные H + L, соотношение краситель / белок ∼1.6; Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA), снова промыли и сразу же зафиксировали. Количество связавшегося вторичного антитела Cy5 увеличивалось только примерно в два раза в зависимости от его относительной интенсивности флуоресценции, несмотря на 10-кратную разницу в концентрации.

Когда вторичное антитело использовали для перекрестного связывания меченого 5′-NT, клетки метили указанным D: A IgG 5NT4-2, как указано выше, а затем дважды промывали PBS ⁺⁺ в течение 5 минут при 4 ° C.Затем клетки инкубировали в течение 15 минут при 4 ° C в присутствии или в отсутствие 10 мкг / мл немеченого вторичного антитела (ослиные антимышиные H + L; Jackson ImmunoResearch Laboratories). После промывки, как и раньше, клетки, меченные без вторичных антител, немедленно фиксировали. Клетки, меченные в присутствии вторичных антител, либо фиксировали сразу, либо инкубировали при 37 ° C в течение 15 мин перед фиксацией.

В экспериментах по экстракции детергента клетки метили в течение 15 минут при 4 ° C с помощью 1: 1 D: A 5NT4-2 IgG с последующей 30-минутной инкубацией при 4 ° C либо в PBS ⁺⁺ , либо в PBS. ⁺⁺ , содержащий 1% Тритон Х-100.Затем клетки кратковременно промывали холодным PBS ⁺⁺ и фиксировали в 4% формальдегиде, как указано выше.

FRET широко используется в качестве спектроскопического инструмента для обнаружения молекулярных взаимодействий и близости молекул в растворе, а также в мембранах. {6}].\ end {уравнение *}

Например, когда r = R _o , E составляет 50%, а когда r = 2 R _o , E составляет 1,5%. Значение R _o зависит от относительной ориентации донора и акцептора, интервала перекрытия между спектром излучения донора и спектром возбуждения акцептора, а также квантового выхода флуоресценции донора.В наших экспериментах в качестве донора использовался Cy3, а в качестве акцептора — Cy5. R _o для этой пары донора и акцептора было рассчитано как 50 Å (Bastiaens and Jovin, 1996), принимая фактор ориентации κ ² , равный 2/3 (Dale et al., 1979). Для этого значения R _o , когда r = 50 Å, E составляет 50%, а когда r = 100 Å, E составляет 1,5%.

Экспериментально FRET можно обнаружить несколькими способами.Перенос энергии вызывает тушение донорной флуоресценции и сенсибилизированной флуоресценции акцептора. Это также сокращает срок жизни донора и снижает скорость необратимого фотообесцвечивания донора (Clegg, 1995, 1996). Для измерения всех этих событий были разработаны методы визуализации FRET. Описанные на сегодняшний день методы измерения передачи энергии после фотообесцвечивания доноров (Kubitscheck et al., 1991, 1993; Hannan et al., 1993; Damjanovich et al., 1995; Gadella and Jovin, 1995; Jurgens et al., 1996), вариации на флуоресценцию сенсибилизированных акцепторов (Uster, Pagano, 1986; Adams et al., 1991; Bacskai et al., 1993; Kam et al., 1995), тушение донора (Kindzelskii et al., 1994; Xue et al., 1994; Bastiaens, Jovin, 1996; Bastiaens et al., 1996; Kindzelskii et al., 1996) и продолжительность жизни донора ( Oida et al., 1993).

В настоящем исследовании FRET был измерен с использованием метода, разработанного для лазерного конфокального микроскопа (Bastiaens and Jovin, 1996; Bastiaens et al., 1996), модифицированного нами для использования с обычным микроскопом с дуговой лампой (Kenworthy and Edidin, 1997). .В этом методе образцы метят смесью антител, конъюгированных с донором и акцептором, и перенос энергии детектируется как увеличение флуоресценции донора (уменьшение гашения) после полного фотообесцвечивания акцепторного флуорофора. Преимущество этого метода заключается в том, что все параметры, необходимые для количественного определения E , могут быть получены из одного и того же поля клеток, что устраняет необходимость корректировать различия в количестве донорских антител, связанных в образцах, отдельно помеченных донором и акцептором (или только с донором) или для определения спектральных поправочных коэффициентов, необходимых для количественной оценки измерений флуоресценции сенсибилизированного акцептора (Jovin and Arndt-Jovin, 1989, a , b ).Достоверность использования декхеншинга донора для количественной оценки FRET зависит от того факта, что единственным фактором, который может привести к различию в флуоресценции донора в присутствии и в отсутствие акцептора, является перенос энергии.

Чтобы количественно измерить E с помощью этого метода, акцептор должен быть достаточно фотолабильным, чтобы его можно было полностью обесцветить, а флуоресценция донора не должна значительно исчезать, пока изображения получаются в присутствии и в отсутствие акцептора.Клетки, меченные Cy5-конъюгированным IgG, использовали для определения минимального времени, необходимого для полного обесцвечивания Cy5. Обычно Cy5 полностью фотообесцвечивается за 7 минут или меньше непрерывного возбуждения дуговой лампы с использованием набора фильтров Cy5 и дополнительного длиннопроходного фильтра 570 нм в тракте возбуждения. В этих условиях обесцвечивалось более 97% Cy5, и ни один Cy3 не отбеливался в контрольных образцах, меченных только Cy3 IgG. (В отсутствие длиннопроходного фильтра небольшое количество Cy3 было обесцвечено во время отбеливания Cy5.Это показывает, что Cy3 достаточно стабилен, чтобы позволить количественное сравнение флуоресценции донора до и после фотообесцвечивания акцептора. Обратите внимание, что в этих экспериментах Cy5 был обесцвечен со всего поля клеток.

Для проведения эксперимента по визуализации FRET образцы были помечены как Cy3-, так и Cy5-конъюгированными антителами в указанных молярных соотношениях, как описано выше. Первоначальное изображение флуоресценции Cy3 (в присутствии антител, конъюгированных с Cy5) получали с использованием набора фильтров Cy3.Изображение флуоресценции Cy5 получали с использованием набора фильтров Cy5 и дополнительного длиннопроходного фильтра 570 нм в тракте возбуждения, а затем образец непрерывно освещали в течение 7 мин. Затем было получено изображение флуоресценции Cy5 после фотообесцвечивания (<3% от начальной интенсивности), длинный фильтр был удален и другое изображение флуоресценции Cy3 было получено с использованием набора фильтров Cy3. Данные были собраны для четырех-пяти различных полей из одного покровного стекла. Интенсивности флуоресценции указаны в произвольных единицах и сопоставимы в рамках данного эксперимента, но их нельзя сравнивать напрямую между экспериментами.

Изображения, отображающие FRET между мечеными молекулами 5 ‘NT, были рассчитаны по увеличению флуоресценции донора после фотодеструкции акцептора на

\ begin {уравнение *} {\ mathit {E}} (\%) {\ times} 100 = 10 000 {\ times} [(Cy3 \; postbleach-Cy3 \; prebleach) / Cy3 \; postbleach] \ end { уравнение *}

после вычитания вклада темнового тока и корректировки регистрации изображений с использованием алгоритма регистрации индекса Isee Pratt.Коэффициент масштабирования 10 000 использовался для расширения E (который масштабируется от 0–1) до масштаба 12-битных изображений (0–4 096). Таким образом, значение 4096 соответствует E , равному 0,4096, или 40,96%. Для клеток, меченных только донором (D: A = 1: 0), значительного переноса энергии не наблюдалось ( E <2–3%).

Изображения эффективности передачи энергии потенциально можно анализировать попиксельно.Однако, поскольку вариации от ячейки к ячейке в E содержат информацию о распределении 5 ′ NT (см. Ниже), для дальнейшего анализа мы усреднили по интересующим областям размером 40 × 40 пикселей (17,64 мкм ² при 63 × , или 6,97 мкм ² при 100 ×), выбранных из клеток, которые были в фокусе. Для каждой ячейки была выбрана одна интересующая область, и эти области были выбраны так, чтобы они избегали краев ячеек, где иногда возникали артефакты на изображениях эффективности передачи энергии. Средние интенсивности флуоресценции и E были рассчитаны для идентичных представляющих интерес областей для зарегистрированных изображений Cy3 prebleach, Cy5 prebleach, Cy3 postbleach и E изображений.От 10 до 30 представляющих интерес областей были выбраны из каждого поля клеток, так что были взяты образцы клеток, покрывающих полный диапазон уровней экспрессии 5′-NT. В экспериментах, где кластеризация 5′-NT индуцировалась вторичным антителом, данные также собирали с представляющими интерес квадратными областями размером 5 × 5 пикселей для областей на клетках, которые были либо лишены 5′-NT, либо обогащены кластерами. Из-за небольшого размера выборки эти данные были более зашумленными и разбросаны вокруг среднего значения E , полученного с использованием областей выборки размером 40 × 40 пикселей (данные не показаны).

Мы измерили FRET по уменьшению флуоресценции донора после полного фотообесцвечивания акцепторного флуорофора. Данные типичного эксперимента по визуализации FRET показаны на рис. 1. Изображение исходного донора (Cy3) представляет флуоресценцию донора в присутствии акцептора Cy5 (рис. 1, a ). Как и ожидалось, изображение Cy5, полученное до фотообесцвечивания (рис. 1, b ), было идентично изображению Cy3, поскольку для донорной и акцепторной меток использовалось одно и то же антитело.После полного обесцвечивания акцептора (Cy5) (фиг. 1, d ) было получено изображение второго донора (Cy3) (фиг. 1, c ). Флуоресценция донора (Су3) в некоторых клетках увеличилась (рис.1, a и c , стрелки ), в то время как в других клетках флуоресценция донора практически не изменилась (рис. , a и c , наконечники стрелок ). Повышенная флуоресценция донора после разрушения акцептора указывает на то, что флуоресценция донора гасится в присутствии акцептора из-за передачи энергии.В общем, наибольшее снижение гены наблюдалось в клетках, экспрессирующих наибольшее количество белка.

Изображения E были рассчитаны на основе изображений доноров, полученных до и после фоторазрушения акцептора, с использованием уравнения (1). 2. Вычисленное изображение E для данных на рис. 1 показано на рис. 2, a . Между мечеными молекулами 5′-NT происходил значительный перенос энергии. Как показано на рис.2 a , E существенно варьировала от клетки к клетке, в этом эксперименте от 10% до более 30%, и была высокой в ​​клетках, экспрессирующих высокие количества 5′-NT на апикальной плазматической мембране.

Вариация от клетки к клетке в E содержит информацию о распределении молекул 5 ‘NT на поверхности клетки (см. Таблицу I, тест 3 ). Чтобы получить эту информацию, мы взяли образцы средних значений E , интенсивности флуоресценции акцептора и интенсивности флуоресценции донора после фотодеструкции акцептора из представляющих интерес квадратных областей размером 40 × 40 пикселей на отдельных клетках (рис.1, c , ящик ). Эта площадь составляет ∼1 / 5 при 63 × или 1/15 при 100 × проекции площади поверхности ячейки ∼100 мкм ² . Связь между E и акцепторной флуоресценцией для клеток, показанных на фиг. 1, графически показана на фиг. 2, b . Каждая величина представляет собой среднее значение E и флуоресценцию акцептора, взятую из одной из клеток в поле. Поскольку флуоресценция акцептора (хотя и выражается в произвольных единицах) пропорциональна относительной поверхностной плотности (количеству белков на единицу площади) 5 ′ NT, рис.2 b показывает, что E увеличивается в зависимости от увеличения поверхностной плотности молекул 5 ′ NT.

В зависимости от распределения молекул, меченных донорами и акцепторами, E может зависеть от поверхностной плотности донора и / или акцепторов, степени мечения и D: A (Таблица I и Приложение). В наших экспериментах поверхностная плотность 5′-NT варьировалась от клетки к клетке, поскольку клетки различались по экспрессии белка (рис.1). Поверхностная плотность доноров и акцепторов может быть изменена путем изменения D: A, соотношения меченных донором и акцептором антител, используемых для мечения клеток. Мы ожидали, что для 5′-NT, случайно распределенных на поверхности клетки, передача энергии между помеченными 5′-NT будет масштабироваться с поверхностной плотностью акцептора, независимо от того, как изменялась поверхностная плотность акцептора. То есть мы ожидаем аналогичных значений передачи энергии для клеток с высокой поверхностной плотностью 5′-NT, но меченных низкой концентрацией конъюгированных с акцептором антител, и для клеток с низкой поверхностной плотностью 5′-NT, но меченных высокой концентрация акцепторного антитела при условии, что поверхностная плотность акцептора одинакова в каждой группе клеток (таблица I, рис.1, 2). Не ожидалось, что передача энергии будет масштабироваться с поверхностной плотностью, если 5 ‘NT были распределены исключительно в кластерах (Таблица I).

На рис. 3 показана экспериментальная зависимость E от D: A, поверхностной плотности донора и поверхностной плотности акцептора. Когда клетки были помечены постоянной молярной концентрацией меченного донором IgG, с увеличением концентрации меченного акцептором IgG, чтобы получить D: A в диапазоне от 1: 0.5 к 1: 5. Можно видеть, что для одиночного D: A перенос энергии увеличивается с увеличением поверхностной плотности 5 ′ NT, измеренной в терминах донорной (рис. 3, a ) или акцепторной (рис. 3, b ) флуоресценции. , и стремилась к нулю в пределе малых поверхностных плотностей. Эта зависимость E от поверхностной плотности несовместима с моделью, в которой вся поверхность 5 ′ NT находится в кластерах (Таблица I).

Для заданной поверхностной плотности донора (рис.3, a ), E увеличилось по мере увеличения D: A с 1: 0,5 до 1: 5. Это видно по раздвоению кривых данных на рис. 3, и . Напротив, для данной поверхностной плотности акцептора (рис. 3, b ) значение E было примерно одинаковым для всех исследованных D: A. Отметим также, что форма экспериментальных кривых была аналогична той, которая была предсказана для случайно распределенных молекул (рис.2), хотя их нельзя здесь напрямую сравнивать, поскольку поверхностная плотность акцептора и r неизвестны (см. Оценку ниже. ).

Сильная зависимость E от поверхностной плотности акцептора, но не от поверхностной плотности донора, согласуется с теоретическим предсказанием для доноров и акцепторов, случайно распределенных в плоскости мембраны (рис. 2). Однако эта независимость E от поверхностной плотности донора сохраняется только в пределе, когда в возбужденном состоянии мало доноров по сравнению с числом присутствующих акцепторов (Fung and Stryer, 1978).В соответствии с этим мы обнаружили, что если клетки были помечены постоянной концентрацией акцептора (50 мкг / мл) и различными количествами донора для получения указанного D: A, передача энергии фактически уменьшалась, поскольку концентрация донора увеличивалась, давая D : A из 5: 1 (рис. 3, c ). Для образцов, меченных низкими концентрациями донора (D: A 0,5: 1 и 1: 1), данные были аналогичны описанным выше (фиг. 3 b ). Поэтому во всех наших экспериментах образцы для FRET были помечены постоянной низкой концентрацией донора (50 мкг / мл) и различными концентрациями акцептора.

Мы рассмотрели возможность того, что двухвалентный IgG, используемый для метки 5′-NT, может нарушить его нормальное мембранное распределение. Чтобы проверить это, мы повторили эксперименты на фиг. 3, a и b , используя клетки, меченные одновалентным Fab. На рис. 4 показаны результаты такого эксперимента. Как указано выше, клетки метили постоянным количеством донора и увеличивающимся количеством акцептора. Картина иммунофлуоресцентного мечения была аналогичной для клеток, меченных IgG и Fab (данные не показаны).Как мы наблюдали для образцов, меченных IgG, E как функция поверхностной плотности акцептора была примерно одинаковой для всех D: A (рис. 4 b ). Однако для образцов, меченных Fab, наблюдалось небольшое, но систематическое увеличение E с увеличением концентрации акцептора. В эксперименте, в котором мы напрямую сравнивали величину E при данной интенсивности флуоресценции акцептора для образцов, меченных IgG, по сравнению с Fab, мы обнаружили, что E была выше для Fab-меченных образцов (данные не показаны).Скорее всего, это связано с различиями в соотношении краситель / белок для молекул, меченных акцепторами (4,1 для Fab против 1,7 для IgG), но это также может быть связано с различиями в размере и / или относительной гибкости Fab и IgG. (Кам и др., 1995; Матко, Эдидин, 1997). Эти факторы также могут объяснять увеличение E с увеличением концентрации акцепторного Fab.

Мы также провели измерения FRET в клетках, которые не были инкубированы с бутиратом, но которые, тем не менее, показали обнаруживаемые количества 5 ‘NT.Эти эксперименты проводились по двум причинам. Во-первых, мы хотели дополнительно проверить зависимость E от поверхностной плотности 5 ′ NT, чтобы увидеть, экстраполировано ли E к нулю при низких поверхностных плотностях (Таблица I). Во-вторых, обработка бутиратом, используемая для индукции высокой экспрессии 5′-NT, может создавать артефакты из-за сверхэкспрессии белка. Например, обогащение 5′-NT микродоменами в клетках, обработанных бутиратом, может быть ограничено доступностью других компонентов предполагаемых микродоменов.В соответствии с более низкими поверхностными плотностями 5 ‘NT, мы обнаружили, что E было соответственно ниже на необработанных клетках (данные не показаны и на фиг. 6 и 7). Как мы обнаружили для клеток, обработанных бутиратом, при данной поверхностной плотности акцептора E было одинаковым для всех исследованных D: A (данные не показаны). Это говорит о том, что на распределение 5 ‘NT не влияет уровень экспрессии белка.

В описанных выше экспериментах поверхностная плотность акцепторов выражалась в произвольных единицах; следовательно, мы не могли напрямую сравнивать экспериментальные данные с теоретическими предсказаниями.Чтобы сравнить экспериментальные данные с теоретическими предсказаниями, мы оценили абсолютную поверхностную плотность акцепторов на клеточных мембранах по измеренным интенсивностям флуоресценции с использованием набора калибровочных стандартов, шариков диаметром 8 мкм с известной способностью связывания антител. На рис.5 сравниваются экспериментальные значения E , построенные как функция абсолютной поверхностной плотности акцептора (рис.5, a ), с теоретическими значениями E для случайно распределенных доноров и акцепторов (рис.5, б ). По нашим оценкам, максимальная поверхностная плотность акцепторов составляет 20 000 на мкм ² (рис. 5, a ). Эти значения высоки и могут быть завышены, но они не беспрецедентны (Rothberg et al., 1990; Hille, 1992). Теоретические кривые (рис. 5 b ) были рассчитаны для значений максимального сближения, r , в диапазоне от r = 0, где донор и акцептор находятся в физическом контакте, до r = 2 R _o , где максимально возможное сближение донора и акцептора ограничено 100 Å.Если r приблизительно соответствовать диаметру меченных донорами и акцепторами молекул (Zimet et al., 1995), r = 1,5 R _o будет примерно сопоставимо с размером Fab, который оценивается как цилиндр диаметром 80 Å и высотой 70 Å (Kubitscheck et al., 1993).

Сравнение рис. 5, a и b показывает, что общие формы экспериментальных и теоретических кривых аналогичны, и что экспериментальные данные находятся в пределах диапазона теоретических предсказаний.Экспериментальные данные аналогичны теоретическим кривым для r = 0 при низких поверхностных плотностях и r = 1,5 R _o при высоких поверхностных плотностях. Хотя это изменение r в зависимости от поверхностной плотности может отражать биологию 5 ′ NT, оно также может быть результатом ошибок в оценке поверхностной плотности акцептора и того факта, что теоретические расчеты предполагают наличие одного флуорофора на молекулу белка. , в то время как наши метки Fab и IgG несут два или более флуорофоров на молекулу.

В качестве прямого теста того, может ли наш метод обнаруживать сгруппированные молекулы, мы измерили передачу энергии от меченных донором анти-5 ‘NT Ig к меченным акцептором анти-Ig антителам. Прямое связывание вторичных антител с первичными антителами должно приводить к относительно высоким значениям E , а E должно отражать комбинированный вклад «сгруппированных» (непосредственно связанных) и случайно распределенных молекул (Приложение).Мы ожидаем, что эта система должна вести себя как смесь случайно распределенных и сгруппированных молекул, где f _{сгруппировано} является постоянным (таблица I, рис. A3, a и b ). Хотя сначала может показаться, что, поскольку акцепторы связывают доноров, это должно быть эквивалентно модели, представленной на рис. 3 c , это не так, потому что в нашем эксперименте соотношение первичных и вторичных антител, связанных с любым данная ячейка, и, следовательно, f _{сгруппированы} , является константой.

Как и ожидалось, для образцов, меченных донорскими конъюгированными первичными и акцепторно-конъюгированными вторичными антителами, количество вторичных антител, связанных с любой данной клеткой, было прямо пропорционально количеству связанных первичных антител и, таким образом, пропорционально поверхностной плотности 5 ‘ NT (данные не показаны). По сравнению с контрольным образцом, меченным первичными антителами, конъюгированными с донором и акцептором, значительно более высокие значения E наблюдались для образцов, меченных первичными антителами, конъюгированными с донором и вторичными антителами, конъюгированными с акцептором (рис.6). Более того, в сгруппированных образцах E увеличивалось по мере увеличения концентрации конъюгированного с акцептором вторичного антитела, используемого для мечения клеток. В этом эксперименте E увеличивалось с максимума ∼20% до максимума, близкого к 40%, поскольку D: A увеличивалось с номинального отношения 1: 0,1 до 1: 1. Для сравнения, E , равное 28%, было измерено между A- и B-субъединицами интактной структуры холерного токсина, молекулами в молекулярном контакте (Bastiaens et al., 1996).

Увеличение E , наблюдаемое при увеличении концентрации акцептора в D: A, могло отражать увеличение доли доноров, с которыми были связаны акцепторы ( f _{кластеризовался} в уравнении A5), увеличение количество акцепторов (вторичных антител), связанных с донором ( E, , _{, кластер} в уравнении A5), или оба. E для кластеризованных молекул также показали некоторую зависимость от поверхностной плотности акцептора.Вероятно, это связано с межкластерной передачей энергии. Особо обратите внимание на то, что при наименьшей наблюдаемой поверхностной плотности E для контрольного образца было менее 5% по сравнению с> 10% или> 20% для образцов, меченных 5 или 50 мкг / мл вторичного антитела, меченного акцептором, соответственно.

GPI-заякоренные белки на поверхности клетки могут быть сгруппированы путем перекрестного связывания вторичным антителом (Mayor et al., 1994; Fujimoto, 1996) или экстракцией клеток детергентом (Mayor and Maxfield, 1995). Если эта кластеризация также происходит в масштабах молекулярной длины, это должно вызывать заметное изменение в передаче энергии между мечеными молекулами 5′-NT.

Для кластеризации 5′-NT с вторичным антителом клетки метили антителом, конъюгированным с донором и акцептором, с последующим вторичным антителом против IgG и короткой инкубацией при 37 ° C.При такой обработке метка группируется в большие точечные структуры (Fig. 7, c ). Для данной поверхностной плотности акцептора более высокие значения E наблюдались в клетках, меченных вторичным антителом, чем в контрольных клетках (фиг. 7, e ). Эта разница была не очень большой, отчасти потому, что для кластерного образца E является средним значением для областей, обедненных и обогащенных 5 ′ NT (рис. 7 d ). Этот результат согласуется с сообщением о том, что среднее значение E для клеток, меченных донорским и акцепторным меченым конканавалином A, было сходным в условиях, когда метка была окрашена кольцом и когда она была исправлена ​​(Dale et al., 1981).

5 ‘NT обнаруживается в микродоменах мембран низкой плотности, не растворимых в детергентах, в эпителиальных клетках кишечника (Strohmeier et al., 1997) и эндотелиальных клетках легких крыс (Schnitzer et al., 1995). Чтобы увидеть, изменила ли экстракция Triton X-100 организацию 5′-NT в интактных клеточных мембранах MDCK, живые клетки метили при 4 ° C антителами, меченными донорами и акцепторами, а затем инкубировали на льду с 1% Triton X-100 для 30 мин до фиксации.Как сообщалось для других GPI-заякоренных белков (Mayor and Maxfield, 1995), 5’-NT не был значительно солюбилизирован в этих условиях, поскольку интенсивность и характер его мечения были очень похожи на контрольные клетки (фиг. 8). Однако в некоторых клетках были очевидны темные немеченые области в мембране (предположительно отверстия), что указывало на то, что другие компоненты мембраны были солюбилизированы (фиг. 8, c , стрелка ). E , измеренная после экстракции детергента, была систематически выше, чем контрольные, что соответствовало переходу к частично кластерному распределению 5 ‘NT после экстракции детергента (рис.8 и ).

Эти результаты предполагают, что не все 5′-NT были сгруппированы после вторичного мечения антител или экстракции детергентом, а вместо этого присутствовали как смесь случайно распределенных и сгруппированных молекул. К этому моменту важно отметить, что изменения (или их отсутствие) в видимой организации белка на световом или даже электронно-микроскопическом уровне могут не коррелировать напрямую с изменениями, обнаруженными FRET, поскольку они измеряют расстояния на разной длине. весы (ок.ф., Дамьянович и др., 1995).

Мембранные микродомены, обогащенные GPI-заякоренными белками, GSL и холестерином, были оперативно определены в терминах нерастворимых в детергентах мембранных фракций с низкой плотностью; однако эти микродомены не были обнаружены другими методами (для обзора см. Harder and Simons, 1997). В настоящем исследовании мы использовали визуализацию FRET, метод, который увеличивает разрешение иммунофлуоресцентной микроскопии до молекулярного масштаба, чтобы исследовать микродомены, обогащенные GPI-заякоренным белком, в апикальной плазматической мембране клеток MDCK.Мы ожидали, что если большая часть GPI-заякоренного белка 5′-NT находится в микродоменах мембраны, то мы сможем обнаружить FRET между 5′-NT молекулами, что согласуется с кластеризацией (Таблица I).

Используя визуализацию FRET, мы получили изображения, которые показали значительные различия от клетки к клетке в эффективности передачи энергии между мечеными молекулами 5′-NT. E сильно коррелировал с поверхностной плотностью 5 ′ н.т. и приближался к нулю при низких поверхностных плотностях (рис.3–6). Эти наблюдения предполагают, что большая часть 5′-NT не находится в кластерах на апикальной мембране клеток MDCK; если бы это было так, мы бы ожидали получить высокие значения E даже при низкой поверхностной плотности (Таблица I). Эти наблюдения не были связаны с неспособностью метода обнаружить кластеры, поскольку мы обнаружили кластерные доноры и акцепторы в простой модельной системе, вторичные антитела, связанные с первичными антителами (рис. 6).

Отчетливая зависимость E от поверхностной плотности 5 ′ NT (рис.3–6) согласуется либо с полностью случайным распределением белка, либо со смесью случайно распределенных и сгруппированных 5′-NT (Таблица I). Если некоторые 5 ‘NT находятся в кластерах, а некоторые распределены случайным образом, мы ожидаем, что E не обязательно будет стремиться к нулю в пределе низкой поверхностной плотности, а E будет чувствительным к D: A (Таблица I). Если в кластерах мало или совсем нет 5 ′ NT, то мы ожидаем, что E упадет до нуля в пределе низкой поверхностной плотности, чтобы быть нечувствительным к D: A.

Мы обнаружили, что E приближается к нулю в пределе низких поверхностных плотностей 5 ′ НТ (рис. 3–6), а форма экспериментальных кривых аналогична теоретически предсказанной для случайного распределения (рис. 5). E сильно зависит от поверхностной плотности акцептора, а не от поверхностной плотности доноров для относительно низких концентраций донорного флуорофора. Независимо от D: A, данные отдельного эксперимента имели тенденцию попадать на одну кривую при построении графика как функции поверхностной плотности акцепторов в клетках, экспрессирующих широко варьирующие концентрации белка (рис.3). Однако в некоторых экспериментах (рис. 4) мы наблюдали небольшие сдвиги в E для образцов, помеченных разными соотношениями D: A, что указывает на то, что некоторые кластеры могут присутствовать. Таким образом, мы не можем полностью исключить возможность того, что, хотя большинство из них распределено случайным образом, некоторые молекулы 5′-NT объединяются в кластеры. Мы ожидаем, что при некоторых обстоятельствах FRET для смесей случайно распределенных и сгруппированных молекул будет казаться похожим на FRET для чисто случайного распределения, особенно в пределе, когда f _{сгруппировано} и / или E _{сгруппировано} мало и f _{случайный} и / или E _{случайный} большой (см. Приложение).Это могло бы объяснить, например, почему мы не наблюдали большего эффекта на E в клетках, где мы индуцировали кластеризацию GPI-заякоренных белков за счет вторичного перекрестного связывания, индуцированного антителами, или путем экстракции детергентом интактных клеток (рис. 7 и 8). ). Мы подсчитали, что если 10% молекул будут сгруппированы, данные для смешанной популяции будут выглядеть очень похожими на чистое случайное распределение (при условии, что r = R _o ). Однако большие различия ожидаются, когда f _{сгруппированы} = 50% (см. Приложение).Основываясь на этих наблюдениях, простейшая интерпретация наших данных состоит в том, что 5 ′ NT в условиях наших экспериментов преимущественно распределены случайным образом.

Важно подчеркнуть, что наш вывод о том, что 5′-NT преимущественно распределен случайным образом, зависит от наличия FRET, а не его отсутствия. В предыдущем исследовании нашей лаборатории не было обнаружено FRET между мечеными молекулами gD1-DAF в стационарных условиях, что означает, что gD1-DAF был диспергирован, т.е.е., распределены случайным образом (Hannan et al., 1993). Однако отсутствие FRET не обязательно исключает возможность объединения молекул в кластер, поскольку среди других возможностей расстояние, разделяющее их в кластере, может быть больше, чем может быть обнаружено FRET. В настоящем исследовании мы смогли обнаружить FRET между мечеными молекулами 5 ‘NT; это указывает на то, что в среднем белки уже находятся в пределах 10 Å друг от друга. Это является дополнительным доказательством того, что FRET может обнаруживать обогащение 5’-NT в микродоменах, т.е.е., липидные рафты. Повторное изучение латеральной организации gD1-DAF с использованием нашего текущего метода FRET показывает, что перенос энергии обнаруживается между мечеными молекулами gD1-DAF в стационарных условиях и коррелирует с поверхностной плотностью белка, аналогично нашим результатам для 5 ‘NT (Nguyen, Т., А. Кенуорти, М. Эдидин, неопубликованные наблюдения). Разница между нашими прошлыми и настоящими результатами может быть связана с более низкими концентрациями (поверхностной плотностью) меченых антител в наших предыдущих экспериментах и ​​чувствительностью текущего метода к межклеточным вариациям в E .Это дополнительно подчеркивает наиболее важное преимущество визуализации FRET по сравнению с экспериментами с FRET без визуализации, которые обычно дают средние значения E для популяции клеток (Hannan et al., 1993; Matko and Edidin, 1997): визуализация FRET генерирует изображения, отображающие передачу энергии эффективность. Хотя в текущем исследовании мы сосредоточились на гомоассоциациях белков, визуализация FRET также уникально подходит для выполнения «визуализации биохимии» белок-белковых и белок-липидных гетеро-взаимодействий в интактных клетках.

Для дальнейшей проверки нашего вывода о том, что большая часть 5′-NT распределена случайным образом на поверхности клетки, потребуется количественное сравнение наших данных с теоретическими предсказаниями. Варианты аналитического подхода, который мы здесь применили, использовались для количественной интерпретации данных FRET в различных мембранных системах (например, Holowka и Baird, 1983, a , b ; Dewey and Datta, 1989; John and Jähnig, 1991; также см. более полный список в Mátyus, 1992 и Clegg, 1996).Однако наши возможности расширить наш текущий анализ с качественного на количественный ограничены несколькими факторами. Во-первых, существует некоторый разброс в кривых зависимости передачи энергии от поверхностной плотности акцептора, который может скрывать различия в наборах данных. Факторы, способствующие этой вариабельности, включают неоднородности возбуждения в поле зрения, небольшие локальные вариации в тушении донора и присущую неоднородность рисунка флуоресцентного мечения на поверхности клетки из-за присутствия микроворсинок и кривизны самой апикальной мембраны. .Во-вторых, нижний предел обнаруживаемости FRET с помощью нашего метода составляет консервативно 5%, хотя во многих экспериментах мы измеряли кажущееся E для отрицательных контролей (помеченных только донором) всего на 2–3% (рис. 4). Это можно улучшить дополнительным вычитанием фона. В текущих экспериментах, поскольку мы визуализировали конфлюэнтные монослои клеток, единственное вычитание фона, которое мы включили, было для так называемого темнового тока, постоянного вклада из-за шума от камеры CCD.При более высокой чувствительности мы могли с большей уверенностью оценить экстраполяцию E и поверхностную плотность акцептора к нулю. В-третьих, есть пределы нашему сравнению экспериментальных результатов с теорией и с самими теоретическими расчетами. Наша способность строго проверять теоретические предсказания была бы улучшена за счет более точных оценок поверхностной плотности акцептора и r . Физически обоснованное приближение r , например, потребовало бы более подробной структурной информации о 5′-NT, включая положение эпитопа и ориентацию связанного антитела.К этому моменту отметим, что был разработан ряд сложных анализов, которые включали подробную информацию об экспериментальной системе, такую ​​как положение донорного флуорофора на интересующей молекуле (например, Zimet et al., 1995). Этот вид информации может быть с успехом применен при анализе данных FRET для получения более качественных экспериментальных систем. Анализ также может быть улучшен за счет более совершенных теоретических моделей для смешанных популяций, включая конкретные перекрестные члены между случайно распределенными и сгруппированными молекулами.

Хорошо известно, что распределение GPI-заякоренных белков в клеточных мембранах чувствительно к условиям фиксации и мечения. Например, сообщалось, что GPI-заякоренный рецептор фолиевой кислоты сгруппирован (Rothberg et al., 1990), но впоследствии было показано, что это индуцируется перекрестным связыванием вторичных антител (Mayor et al., 1994). Кластеризация самого 5′-NT также была показана после перекрестного связывания антител (Howell et al., 1987). В наших экспериментах мы наблюдали очень похожие, диспергированные паттерны мечения, продуцируемые либо моновалентным Fab, либо двухвалентным IgG, когда клетки фиксировали непосредственно после мечения. Кроме того, организация первичных антител стала более пунктированной (сгруппированной) в присутствии вторичных антител (фиг. 7 и данные не показаны). Таким образом, наши результаты аналогичны предыдущим отчетам в этом отношении (Rothberg et al., 1990; Mayor et al., 1994). Однако совсем недавно проведенная работа предполагает, что определенные условия фиксации могут действовать для рассеивания ранее существовавших кластеров рецептора фолиевой кислоты (Wu et al., 1997), вновь открывая вопрос о том, как лучше всего стабилизировать нативное распределение GPI-заякоренных белков. Этот вопрос потребует дальнейшего изучения. Тем не менее, наши текущие результаты согласуются с сообщениями (Parton et al., 1994; Mayor and Maxfield, 1995; Fujimoto, 1996; Rijnboutt et al., 1996) о преимущественно случайных стационарных распределениях GPI-заякоренных белков, измеренных в уровень разрешения электронного микроскопа. По сравнению с электронной микроскопией, визуализация FRET имеет преимущества более высокой эффективности маркировки, большего размера образца и, что наиболее важно, повышенного разрешения до молекулярного уровня.

Первым экспериментальным доказательством существования мембранных микродоменов, обогащенных GPI-заякоренными белками, было выделение в виде плавучих комплексов нерастворимых в детергенте мембранных фракций, обогащенных GPI-заякоренными белками, GSL и холестерином из клеток MDCK (Brown and Rose, 1992). Было обнаружено, что GPI-заякоренный белок PLAP становится детергентом, нерастворимым в Golgi, свойство, которое сохраняется даже после того, как белок достигает апикальной мембраны (Brown and Rose, 1992).Позднее было показано, что дополнительные компоненты нерастворимых в детергенте мембранных микродоменов включают трансдуцирующие сигналы липид-модифицированные белки, такие как нерецепторные тирозинкиназы и кавеолярный маркер кавеолин (Stefanova et al., 1991; Sargiacomo et al., 1993; Arreaza et al., 1994; Мелконян и др., 1995). Недавно ряд исследований помог прояснить взаимосвязь между мембранными микродоменами, обогащенными GPI-заякоренными белками, комплексами, не растворимыми в детергенте, и кавеолами, инвагинациями плазматической мембраны размером 70–100 нм, украшенными белком кавеолином (Fra et al. ., 1994; Schroeder et al., 1994; Городинский и Харрис, 1995; Мэр и Максфилд, 1995; Schnitzer et al., 1995, 1996; Смарт и др., 1995; Ханнан и Эдидин, 1996; Ахмед и др., 1997). Эти исследования показывают, что белки и липиды, которые обладают общим свойством нерастворимости детергента, не обязательно связаны в интактных клеточных мембранах, но оставляют открытым вопрос о размере и природе микродоменов до экстракции детергента (Kurzchalia et al., 1995; Edidin, 1997; Harder and Simons, 1997; Weimbs et al., 1997). Очевидно, что существует потребность в более точном определении того, что составляет функциональный мембранный микродомен в интактных клеточных мембранах.

Наши результаты, полученные с использованием техники визуализации с высоким разрешением, начинают налагать четкие ограничения на структуру микродоменов, обогащенных GPI-заякоренными белками в интактных клеточных мембранах. Мы сообщаем здесь, что GPI-заякоренный белок 5′-NT, который, как известно, ассоциируется с нерастворимыми в детергенте комплексами (Mescher et al., 1981; Schnitzer et al., 1995; Strohmeier et al., 1997), также устойчив к экстракции Triton X-100 в клетках MDCK. Тем не менее, похоже, что большинство 5 ‘NT распределены случайным образом и не сгруппированы по шкале длины <100 Å измерений FRET. Это накладывает ограничения на способы, которыми GPI-заякоренные белки могут связываться с липидными рафтами. Например, наши данные выступают против модели, в которой 5 'NT преимущественно связаны с конечным числом рафтов, поскольку мы ожидали измерить относительно высокий перенос энергии из-за кластеризации белка в рафтах даже при низкой поверхностной плотности 5 ′ Экспрессия NT (рис.3). Ограничения наших текущих измерений не позволяют нам исключить возможность того, что FRET между 5 'NT возникает из-за смеси большой фракции случайно распределенных и небольшой фракции сгруппированных (связанных с плотом) молекул. Однако интересно рассмотреть последствия чисто случайного распределения 5'-NT для структуры липидных рафтов. Если бы это было так, то эти микродомены мембраны должны быть либо исчезающе малыми (в соответствии с современной моделью [Harder and Simons, 1997]), либо альтернативно должны охватывать всю апикальную мембрану.Наши результаты также имеют значение для мембранной организации GPI-заякоренных белков во время мембранного транспорта и сортировки, поскольку предполагается, что биохимические свойства мембранных микродоменов, участвующих в сортировке, и стационарная организация GPI-заякоренных белков схожи. Это может быть дополнительно проверено путем прямого изучения мембранной организации GPI-заякоренных белков и других апикально предназначенных белков и липидов в Golgi. Дальнейшая работа будет также необходима, чтобы определить, могут ли функциональные ассоциации др. Липид-модифицированных белков и GSL быть визуализированы в клеточных мембранах, и опосредуются ли эти ассоциации липид-липидными или белково-липидными взаимодействиями.Визуализация FRET станет мощным инструментом для дальнейшего исследования этих вопросов в интактных клетках.

Для случайно распределенных доноров и акцепторов в мембранах эффективность передачи энергии E _random является функцией R _o , r, и поверхностной плотности акцепторов (Shaklai et al., 1977; Fung и Страйер, 1978; Вольбер и Хадсон, 1979; Дьюи и Хаммс, 1980; Снайдер и Фрейре, 1982; Игерабид, 1994).Здесь r определяется как расстояние наибольшего потенциального сближения доноров и акцепторов. При этом учитывается тот факт, что доноры и акцепторы прикреплены к молекулам, белкам или липидам, которые имеют некоторый конечный размер. Типичное значение r для передачи энергии между маленькими липидными зондами составляет ∼10 Å (Dewey and Hammes, 1980). Для белок-белковых взаимодействий r можно приблизительно определить диаметром белка, например, ∼40 Å для кальциевой АТФазы (Dewey and Datta, 1989; Zimet et al., 1995).

Уравнение, связывающее E _{случайный} , r , R _o , и поверхностную плотность акцептора находится в форме, которую необходимо решать численно, и поэтому был разработан ряд аналитических приближений этого уравнения ( Shaklai et al., 1977; Wolber and Hudson, 1979; Dewey and Hammes, 1980; Snyder and Freire, 1982; Yguerabide, 1994). Два приближения, которые вместе точно охватывают полезный диапазон значений r , взяты из работы Дьюи и Хаммса (1980) и Уолбера и Хадсона (1979).{- {\ mathit {k}} _ {2} {\ mathit {c}} _ {A}}), \ end {формула *}

, где c _A — это так называемая приведенная поверхностная плотность акцептора, безразмерный параметр, равный R _o ² , умноженный на поверхностную плотность акцептора, и A _1,2 и k _1,2 — константы, которые различаются для разных значений r .{-1}. \ End {формула *}

Здесь снова c _A — это уменьшенная поверхностная плотность акцептора, как определено выше. Уравнение A1 действительно для r <1,3 R _o и ур. A2 действительно для r ≥ R _o . Другими ограничивающими условиями являются: ( a ) Количество доноров должно быть достаточно небольшим, чтобы перевод донор-донор был незначительным; ( b ) количество доноров в возбужденном состоянии должно быть небольшим по сравнению с количеством в основном состоянии, чтобы доноры не конкурировали за перенос на данный акцептор; ( c ) r не должны изменяться в течение времени жизни возбужденного состояния донора; и ( d ) все донорно-акцепторные пары должны иметь одинаковые R _o (Fung and Stryer, 1978; Wolber and Hudson, 1979; Zimet et al., 1995).

На рис. A2 мы построим уравнения. A1 и A2 как функция поверхностной плотности акцептора для различных значений r . E _{случайный} зависит от r , достигая своего максимального потенциального значения, когда r приближается к нулю. Для любого заданного значения r , E _random равно нулю в пределе очень низких поверхностных плотностей акцепторов и монотонно увеличивается с увеличением поверхностной плотности акцепторов (рис.А2). Это связано с тем, что по мере увеличения поверхностной плотности расстояние между соседними молекулами, меченными донорами и акцепторами, уменьшается (рис. A1, a и b ). Хотя E _random зависит от поверхностной плотности акцептора, он не зависит от поверхностной плотности донора (уравнения A1 и A2), поскольку каждый донор испытывает одинаковую среднюю поверхностную плотность акцептора. (Как указано выше, это верно только в пределе, когда поверхностная плотность донора достаточно мала, чтобы доноры возбужденного состояния не конкурировали за акцепторы.) Например, если два образца с одинаковой поверхностной плотностью белка были помечены разными D: A (рис. A1, b и c ), E _random будет выше для образца, помеченного более высокая концентрация акцепторов (рис. A1, c ). Отметим также, что, поскольку E _random чувствителен только к поверхностной плотности меченых акцептором молекул, присутствие немеченых молекул не влияет на E _random .Используя эту информацию, можно оценить E _random для молекул на рис. A1, присвоив модели масштаб. Например, если диаметр частицы установлен равным 50 Å ( r = R _o ), то поверхностная плотность акцептора на рис. A1 c составляет 2500 / мкм ² , что дает E _{случайный} из 7% (уравнение A1). {{\ mathit { n}} — 1}).\ end {формула *}

Здесь n — количество звеньев в олигомере, f _DU — общая мольная доля представляющих интерес меченных донорами и немеченых молекул, а E _{олигомер} — эффективность передачи энергии для олигомер. В случае димеров ( n = 2) это упрощается до

\ begin {уравнение *} {\ mathit {E}} _ {clustertered} = {\ mathit {E}} _ {dimer} {\ mathit {f}} _ {A}, \ end {уравнение *}

, где E _димер — эффективность передачи энергии димера, меченного одним донором и одним акцептором, а f _A — мольная доля молекул, меченных акцептором ( f _A + f _D + f _U = 1).Эта модель предсказывает, что E, , _{сгруппированный} будет зависеть как от D: A, так и от степени мечения интересующих молекул. Например, для двух образцов с одинаковой поверхностной плотностью белка (рис. A1, e и f ), если принять димер E = 50% и указанное D: A, то E _{сгруппировано} = (50%) (. 25) = 12,5% для рис. A1, e , в то время как E _{сгруппировано} = (50%) (0,75) = 37,5% для рис.A1, f . Модель кластеров также предсказывает, что E, , _{сгруппированы,} , будут независимы от поверхностных плотностей меченых молекул, представляющих интерес. Таким образом, E _{сгруппированы} = (50%) (0,25) = 12,5% для двух образцов с разной поверхностной плотностью, но помеченных одним и тем же D: A (рис. A1, d и e ). Основываясь на этом предсказании, можно ожидать, что E, , _{сгруппировано,} будет отличным от нуля даже при низких поверхностных плотностях интересующей молекулы.Эти свойства контрастируют с предсказаниями для случайно распределенных молекул (рис. A1, a – c ), где E _random масштабируется строго в соответствии с поверхностной плотностью акцептора (уравнения A1 и A2).

Хотя эта модель может быть чрезмерно упрощена, она предоставляет полезный инструмент для размышлений о том, как E _{с кластеризацией} зависит от D: A, степени мечения и поверхностной плотности доноров и акцепторов для молекул, ограниченных кластерным распределением.Хотя представленная выше модель приравнивает «сгруппированные» молекулы к «связанным» молекулам, это, конечно, не всегда так. В общем, для прогнозирования E _{с кластерами} для более сложных кластерных распределений потребуется более конкретная информация о геометрии сгруппированных молекул, такая как размер и форма кластеров, а также положение флуоресцентного зонда (ов). на интересующие молекулы. E _{кластеризованный} тогда в конечном итоге будет зависеть от вероятности маркировки соседних членов отдельного кластера на расстоянии FRET друг от друга донорами и акцепторами.

Простая модель кластеров, представленная выше, предполагает, что все интересующие молекулы объединены в кластеры. Если присутствует смесь мономерных, случайно распределенных молекул и сгруппированных молекул, мы ожидаем два вклада в смесь E , один от случайно распределенной фракции доноров и акцепторов, а другой от сгруппированных молекул:

\ begin {уравнение *} {\ mathit {E}} _ {смесь} = {\ mathit {f}} _ {random} {\ mathit {E}} _ {random} + {\ mathit {f}} _ {кластеризованный} {\ mathit {E}} _ {кластеризованный}, \ end {уравнение *}

, где f _{случайный} и f _{сгруппированный} — молярные доли случайно распределенных и сгруппированных доноров, соответственно. E _{случайный} — эффективность передачи энергии для случайно распределенных молекул (уравнение A1 или A2), а E _{сгруппировано} — эффективность передачи энергии сгруппированных молекул (например, из уравнения A4 для димеров) . Из этого уравнения немедленно следует, что, поскольку E _random является функцией поверхностной плотности акцептора (уравнения A1 и A2), смесь E также будет зависеть от поверхностной плотности акцептора. Обратите внимание, что для простоты эта модель не включает каких-либо терминов, которые учитывают FRET между кластерами или между кластерами и случайно распределенными молекулами.Такие взаимодействия в дальнейшем будут зависеть более сложным образом от f _{сгруппированных} , f _{случайных} и поверхностной плотности интересующих молекул.

Мы рассмотрим два предельных случая для смешанной совокупности, описываемой уравнением. А5. Первый случай, когда независимо от общей поверхностной плотности интересующих молекул мольная доля случайно распределенных и сгруппированных молекул остается постоянной, другими словами, f _{сгруппированы} , f _{случайны} и E _{сгруппированы} считаются константами.На рис. A3, a показана смесь E _{, рассчитанная для двух разных значений: f сгруппировано , предполагая, что E сгруппировано = 37,5% (аналогично примеру, приведенному для рис. A1, f ) . Результаты этого расчета показывают, что для одного D: A, когда 10% молекул сгруппированы, смесь E лишь немного больше, чем предсказано для чисто случайного случая, но когда 50% молекул сгруппированы , E смесь существенно увеличена по сравнению с E случайным .Величина разницы между E смесью и E random будет зависеть от размера r , поскольку для данной поверхностной плотности акцептора E random становится меньше по мере увеличения r (Рис. A2). Однако, когда кластеры присутствуют, E с кластерами преобладает E смесь при низких поверхностных плотностях акцепторов, где вклад от случайно распределенных молекул наименьший.Таким образом, в этом случае E смесь не обязательно будет экстраполировать до нуля при низких поверхностных плотностях, в то время как E случайная будет. Более того, поскольку E сгруппированный является функцией D: A (уравнения A3 и A4), смесь E также будет чувствительна к D: A. Это проиллюстрировано на рис. A3, b , который показывает, что для смеси случайно распределенных мономеров и димеров, E смесь увеличивается как функция увеличения мольной доли акцептора в смеси D: A (рис.A3 b ).}

Второй предельный случай, который мы рассмотрим для смешанных популяций, имеет место, когда доля сгруппированных по сравнению со случайно распределенными молекулами зависит от поверхностной плотности интересующих молекул. Чтобы исследовать этот эффект, мы будем использовать четко определенную модель, в которой акцепторы напрямую связываются со случайно распределенными донорами (Wolber and Hudson, 1979). Хотя эта модель несколько отличается от других, которые мы обсуждали (поскольку она предполагает, что доноры и акцепторы находятся на двух разных типах молекул, которые образуют гетеродимеры), мы представляем ее здесь, потому что это наглядный пример кластеризации, зависящей от поверхностной плотности. . E _смесь для этого случая можно рассчитать по формуле. A5, позволяя f _random и E _random описывать несвязанных доноров, а f _{с кластеризацией} и E _{с кластером} описывать доноров, связанных с акцептором. Модель предполагает, что одна молекула, меченная донором, связывается с одной молекулой, меченной акцептором, так что f _{сгруппированы} = c _A / c _D .Таким образом, f _{сгруппированы} , f _{случайный} и E _{случайный} все зависят от поверхностной плотности донора, поверхностной плотности акцептора или обоих. На рис. A3, c показана смесь E , рассчитанная для нескольких значений поверхностной плотности донора c _D , при этом E _{сгруппированы,} = 50% для гетеродимера. Эти модельные расчеты показывают, что вклад кластеров в смесь E мал при низких поверхностных плотностях, но становится большим с увеличением поверхностной плотности акцепторов (рис.A3, c ). Это контрастирует со случаем, рассмотренным выше (константа f _{сгруппирована} ), где E _смесь отлична от нуля даже в пределе низких поверхностных плотностей (рис. A3, a и b ). Наконец, поскольку c _D и c _A пропорциональны D: A, опять же в этом случае E _смесь зависит от D: A.

W.M. Keck Center for Cellular Imaging, U.Ва.

Абэ, Фумиёси

Центр исследований экстремобиосферы, Японское агентство морской науки и техники (JAMSTEC), 2-15 Нацусима-чо, Йокосука 237-0061, Япония
[email protected]

Altschuler, Danny
200 Lothrop St, Pittsburgh, PA 15215, United States
[email protected]

Bakowska, Joanna
Bldg. 35- Комната 2C-911, Bethesda, MD 20892, США
bakowskj @ ninds.nih.gov

Barda-Saad, Mira
NCI / NIH, Bethesda, MD 20892-4256, США
[email protected]

Bensenor, Lorena
2370 Austin Drive, Charlottesville, VA 22911, United States
[email protected]

Bhuvanendran, Shivaprasad
332, N Lauderdale, Memphis, TN 38105, United States
[email protected]

Bonamy, Ghislain
College of William and Mary, кафедра биологии, Millington Hall rm 316, Williamsburg, Virginia 23187, United States
gmbona @ wm.edu

Cao, Haiming
Bldg I, Rm 210, 665 Huntington Ave., Boston, MA 02115, США
[email protected]

Caorsi, Valentina
Via Dodecaneso 33, Генуя, Италия 16146, Италия
[email protected]

Роберт Фарисс
7 Мемориал д-р рм. G-23 NIH, Bethesda, Md 20892, США
[email protected]

Ghose, Sraboni
CIS Bio International, BP 84175,30204 BAGNOLS, SUR CEZE Cedex, SUR CEZE Cedex 0000, France
sghose @ cisbiointernational.fr

Холлворт, Ричард
2500 California Plaza, Омаха, NE 68178, США
[email protected]

Hoffpauir, Brian
1 Д-р медицинского центра, PO Box 9303, Morgantown, WV 26506, США
[email protected]

Kleene, Nancy
3125 Eden Ave. Vontz Rm 3106, Cincinnati, Ohio 45267-0521, США
[email protected]

Lee, Kong Heng
Блок конфокальной микроскопии, MD 11, 10 Medical Drive, Центр клинических исследований, # 04-25, Сингапур, Сингапур 117597, Сингапур
nmilkh @ nus.edu.sg

Мартин, Грег
Box 357290, Сиэтл, Вашингтон, 98195-7290, США
[email protected]

Mueller, Susette
E301 Research Bldg., 3970 Reservoir Rd NW, Вашингтон, округ Колумбия 20057-1469, США
[email protected]

Nakanishi, Hideyuki
Hashigami-cho Matsugasaki Sakyo-ku, Киото, Киото 616-8153, Япония
[email protected]

Orme, Alexandra
AZ Charnwood, Bakewell Road, Loughborough, Leicestershire LE11 5RH, UK
[email protected]

Perkins, Ned
3400 n. Charles St., Rm B1 Mudd Hall, Балтимор, Мэриленд 21218, США
[email protected]

Schatten, Heide
1600 E Rollins Street, Columbia, Missouri 65211, United States
[email protected]

Song, Zhao-Hui
Департамент фармакологии, Школа медицины, Луисвилл, KY 40292, США
zhsong @ louisville.edu

Spirou, George
PO Box 9303 Health Sciences Center, Morgantown, West Virginia 26506-9303, США
[email protected]

Убах, М. Кристина
700 Chesterfield Parkway North, GG4L, Честерфилд, Миссури 63017, США
[email protected]

Ye, Kaiming
215 Engineering Hall, Fayetteville, AR 72701, United States
kye @ uark.edu

Zidanic, Michael
502 Robert Grant Ave, Silver Spring, MD 20910, США
[email protected]

Zimmerman, Sandra
MI Institute, Rm 604, 4400 5th Avenue, Pittsburgh, PA 15213, United States
[email protected]