Лада бцр: Яндекс Карты — подробная карта мира

БЦР МОТОРС LADA Нижний Новгород

Если Вы собираетесь покупать Лада не проходите мимо автосалона БЦР МОТОРС LADA Нижний Новгород. На официальном сайте этого дилера представлены комплектации и цены на новые автомобили, а также спецпредложения на авто с пробегом.

На сайте dilert.ru Вы можете ознакомиться с краткой информацией по автомобмлям в наличии, а также с отзывами клиентов.

Сеть
БЦР Моторс

Метро
Пролетарская или Автозаводская

Адрес (Нижний Новгород)
Нижний Новгород, ул. Новикова-Прибоя, 2

Телефон
+7 831 410-45-88

Режим работы
ежедн. 8:00-20:00

Координаты
N56.259813 E43.928668

БЦР МОТОРС LADA Нижний Новгород комплектации и цены

Модель	Кузов	Комплектация	Двигатель	Коробка	Цена
2121 (4×4)	внедорожник	Luxe	1. 7 83 л.c. бензин	механика	537 900
2121 (4×4)	внедорожник	Standard Image	1.7 83 л.c. бензин	механика	747 900
2121 (4×4)	внедорожник 3 дв.	Luxe Snow Queen Urban	1.7 83 л.c. бензин	механика	–
2131 (4×4)	внедорожник	Luxe	1.7 83 л.c. бензин	механика	576 900
2131 (4×4)	внедорожник	Luxe ’18	1.7 83 л.c. бензин	механика	–
Granta	лифтбек	Classic	1.6 87 л.c. бензин	механика	485 500
Granta	хэтчбек	Classic	1.6 87 л.c. бензин	механика	485 500
Granta	седан	Classic	1. 6 87 л.c. бензин	механика	470 500
Granta	универсал	Classic	1.6 87 л.c. бензин	механика	495 500
Largus	универсал	Norma (5 мест)	1.6 87 л.c. бензин	механика	586 900
Largus	фургон	Standard Start	1.6 87 л.c. бензин	механика	549 900
Largus	универсал	Luxe (5 мест)	1.6 102 л.c. бензин	механика	–
Vesta	седан	Classic	1.6 106 л.c. бензин	механика	614 900
Vesta	седан	Luxe	1.8 122 л.c. бензин	механика	818 900
Vesta	седан 2015	Luxe Multimedia	1. 8 145 л.c. бензин	механика	1 045 900
Vesta	универсал	Comfort	1.8 122 л.c. бензин	механика	804 900
Vesta	универсал 5 дв.	Comfort	1.6 106 л.c. бензин	механика	704 900
XRAY	хэтчбек	Classic	1.6 106 л.c. бензин	механика	649 900
XRAY	хэтчбек	Classic Optima	1.8 122 л.c. бензин	механика	791 900

БЦР МОТОРС LADA Нижний Новгород автомобили в наличии

LADA 2121 (4×4)

купить от 518 900 руб

LADA 2121 (4×4)

купить от 722 900 руб

LADA 2121 (4×4)

купить от 581 900 руб

LADA 2131 (4×4)

купить от 557 900 руб

LADA 2131 (4×4)

купить от 620 900 руб

LADA Granta

купить от 451 900 руб

LADA Granta

купить от 451 900 руб

LADA Granta

купить от 434 900 руб

LADA Granta

купить от 461 900 руб

LADA Largus

купить от 564 900 руб

LADA Largus

купить от 534 900 руб

LADA Largus

купить от 714 900 руб

LADA Vesta

купить от 594 900 руб

LADA Vesta

купить от 793 900 руб

LADA Vesta

купить от 1 009 900 руб

LADA Vesta

купить от 779 900 руб

LADA Vesta

купить от 676 900 руб

LADA XRAY

купить от 609 900 руб

LADA XRAY

купить от 754 900 руб

БЦР МОТОРС LADA Нижний Новгород на карте Нижнего Новгорода

Отзывы о БЦР МОТОРС LADA Нижний Новгород

CRM КОРП», внедренного «1С‑Рарус»: от 11.

09.2012 — 1С‑Рарус: Дистрибьюция ПО

Дилерский центр KIA на ул. Новикова-Прибоя, 4 (г. Н. Новгород) Дилерский центр VOLVO компании БЦР МОТОРС Открытие дилерского центра KIA компании БЦР МОТОРС Сотрудники компании БЦР МОТОРС Автомобили KIA Разиков Алексей Александрович, Директор автосалона KIA

Компания «БЦР МОТОРС» работает на рынке 12 лет, являясь одной из старейших компаний, занимающихся автомобильным бизнесом в Нижегородском регионе. Официальный дилер автомобилей KIA, Volvo и Лада в Нижнем Новгороде, а также официальный дилер ГАЗ в Кирове и Челябинске «БЦР МОТОРС» оказывает полный спектр услуг по продаже автомобилей (подбор, оформление кредита, страховки, лизинг, обмен старого автомобиля на новый, содействие в постановке на учет в ГИБДД и обслуживанию автомобилей (установка дополнительного оборудования, гарантийное и послегарантийное обслуживание, кузовной ремонт любой сложности).

Для обеспечения высокого уровня оказываемых услуг компания постоянно совершенствует используемые технологии, инвестирует в обучение персонала и развитие новых видов услуг.

Ранее для повышения уровня сервиса для клиентов, оптимизации процессов отгрузок, контроля складских запасов, наличия автозапчастей в компании использовалась система оперативного учета на платформе «1С:Предприятие 7.7».

Теперь требовалась система для повышения эффективности работы отделов продаж автосалонов KIA и VOLVO на этапах переговоров и дальнейшего сопровождения клиентов, контроля работы call-центра и оптимизации взаимодействия всех подразделений компании.

Руководство предприятия инициировало проект создания корпоративной информационной системы на базе «1С:CRM КОРП». Для реализации нового проекта был выбран Нижегородский филиал «1С-Рарус», имеющий большой опыт работы в области внедрения систем CRM.

По словам Директора автосалона KIA — Разикова Алексея Александровича, — «Внедряя новую систему, мы ориентировались на работу по принципу «Никто из Клиентов не будет забыт». Нам было необходимо, чтобы работа с каждым нашим клиентом была максимальной полной. А для этого было нужно оптимизировать работу сотрудников фронт-лайна».

Ожиданиями от внедрения системы были:

• Рост продаж автомобилей.
• Сокращение времени сотрудников на выполнение рутинных операций.
• Повышение скорости взаимодействия между отделами, исключение случаев потери информации;
• Повышение эффективности использования систем офисной телефонии;
• Повышение уровня удовлетворенности клиентов качеством работы автосалонов, сокращение процента потерянных клиентов.

В ходе проекта с «1С:CRM КОРП» объединены мини-АТС компании, а также используемая система контроля телефонных разговоров.

Для повышения оперативности получения информации об услугах автосервисов, складов автозапчастей и ремонтных зон специалистами «1С‑Рарус» реализована интеграция «1С:CRM КОРП» с системой оперативного учета.

Благодаря внедрению CRM-технологий на платформе «1С:Предприятие 8» в компании «БЦР МОТОРС» была создана единая информационная база клиентов с подробной характеристикой каждого из них, историей контактов и динамикой изменения состояния отношений.

Сотрудники имеют возможность проводить произвольные выборки клиентов и контактных лиц по различным параметрам, а руководство компании теперь может проверять корректность заполнения информации о каждом клиенте.

Для менеджеров отдела продаж и администраторов автосалонов созданы удобные рабочие места с интуитивно понятным интерфейсом. Автоматическая система напоминаний не позволяет забыть про клиента, способствует удовлетворению его потребностей в максимально короткие сроки. Документ «Рабочий лист» фиксирует полную историю взаимоотношений с клиентами.

Аналитические возможности программы «1С:CRM КОРП» позволяют руководству компании «БЦР МОТОРС» всегда быть в курсе событий: контролировать действия менеджеров с помощью легко и оперативно формируемых отчетов, вовремя реагировать на спады продаж, анализировать и планировать деятельность автосалона.

Созданная корпоративная система объединила работу отделов продаж автосалонов KIA и VOLVO, ресепшена, отдела запчастей, отдела тюнинга и приемки на сервисное обслуживание. В общей сложности автоматизировано 30 рабочих мест.

Эффект от автоматизации:

• Рост продаж автомобилей KIA и VOLVO – 40%.
• Исключение случаев потери заявок и пожеланий клиентов при передаче информации между сотрудниками компании.
• Двукратное снижение числа потерянных клиентов за счет оперативной обработки заявок и детального анализа причин отказов.
• Усиление контроля работы менеджеров компании, повышение дисциплины, и как следствие, качества обслуживания клиентов.
• Время на рутинные бумажные операции сокращено практически в 3 раза, повышена производительность труда менеджеров.
• Повышение скорости обслуживания клиентов в 2 раза, за счет использования единой информационной базы с полной информацией всей истории по клиентам и быстрого поиска нужной информации.

Получаемые в ходе плановых опросов клиентов высокие оценки по работе автосалонов служат лучшим подтверждением тому, что новая система помогла реально повысить качество оказываемых услуг и лояльность заказчиков.

О результатах проекта рассказывает Разиков Алексей Александрович, Директор автосалона KIA, куратор проекта со стороны Заказчика, — «Первым показателем того, что выбрав «СRM» мы не ошиблись, был весьма ощутимый рост контрактности. Для нас это стало показателем того, что с клиентами работают грамотно.

Упростился процесс контроля работы наших менеджеров. Система позволяет за несколько минут найти запись нужного нам разговора, прослушать его и дать рекомендации по дальнейшей работе с конкретным клиентом.

Значительно упрощена система отчетов. Поиск нужной информации занимает всего несколько секунд, а развернутые аналитические отчеты формируются очень просто. Таким образом, мы всегда располагаем самой свежей и актуальной информацией, что дает возможность постоянно держать «руку на пульсе».

Пользу мы ощутили не только в работе с клиентами, но и во взаимоотношениях с сотрудниками компании. Предусмотренные «Рабочие листы» не просто отражают всю историю взаимоотношений с клиентом, количество сделанных звонков, оперативность обработки поступающих обращений, но и показывают процент выработки сотрудника. Теперь система мотивации строится только на объективных данных системы, и это повышает лояльность сотрудников.

Мы добились поставленных задач на все 100%. Наша работа с клиентами стала максимально эффективной, а главное, комфортной для самого клиента.

Большое спасибо компании «1С‑Рарус» за профессиональных специалистов, которые не просто реализовывают описываемые нами алгоритмы бизнес-процессов, но и предлагают оптимальные способы по работе с системой».

В дальнейших планах сотрудничества компаний — включение в систему работы отделов страхования, кредитования и сервисного обслуживания, а также внедрение системы CRM в дилерских центрах Лада и ГАЗ.

---

«БЦР МОТОРС» — официальный дилер автомобилей KIA, VOLVO и Лада в Нижнем Новгороде, а также дилер автомобилей ГАЗ в Кирове и Челябинске. Помимо продажи автомашин компания предлагает их обслуживание. Сервис-центры компании оснащены современным оборудованием, способным помочь диагностировать любую неисправность машины, а квалифицированные специалисты устранят ее и дадут рекомендации по дальнейшей эксплуатации.

Дополнительная информация:

г. Нижний Новгород, ул. Новикова-Прибоя, д. 4
Телефон: +7 (831) 2-99999-1
Факс: +7 (831) 257-69-09
http://www.bcr-avto.ru

• 3 Октября 2022

  Основы продвижения в ВК

• 26 Сентября 2022

  Как настроить эффективный процесс работы с дебиторской задолженностью

• 9 Августа 2022

  Июльский дайджест по информационным выпускам «1С»

• 9 Сентября 2022

  Вспомним майскую конференцию в Сочи

БЦР Авто Плюс: отзывы клиентов про официального дилера

• Отзывы автовладельцев
• Официальные дилеры
• БЦР Авто Плюс

• Официальный дилер. Входит в сеть: БЦР МОТОРС
• bcr.lada.ru
• +7 (831) 258-29-99 — Автосалон
  
• Ежедневно: 08:00 — 20:00
• Нижний Новгород, ул. Новикова-Прибоя, д. 2
• LADA
• Новые авто

Отзывы автовладельцев о дилере БЦР Авто Плюс

Здесь пока никто не писал. Напишите отзыв первым!

Написать отзыв о дилере БЦР Авто Плюс

ACAcuraAlfa RomeoAlpinaAlpineAMCArielAroAsiaAston MartinAudiAurusAustinAustin HealeyBAWBeijingBentleyBMWBrillianceBristolBugattiBuickBYDCadillacCallawayCarbodiesCaterhamChanaChanganChangFengChangheCheryChevroletChryslerCitroenCizetaCoggiolaDaciaDadiDaewooDaihatsuDaimlerDallasDatsunDe TomasoDeLoreanDerwaysDFSKDodgeDongFengDoninvestEagleEfiniFAWFerrariFiatFiskerFordFotonFSOFuqiGeelyGeoGMCGreat WallGrozHafeiHaimaHavalHawtaiHindustanHINOHoldenHondaHuangHaiHummerHurtanHyundaiInfinitiInnocentiInvictaIran KhodroIsderaIsuzuIVECOJACJaguarJeepJiangnanJinbeiJMCKiaKoenigseggLADALamborghiniLanciaLand RoverLandwindLDVLexusLifanLincolnLotusLTILuxgenMahindraMarcosMarlinMarussiaMarutiMaseratiMaxusMaybachMazdaMcLarenMegaMercedesMercuryMetrocabMGMinelliMiniMitsubishiMitsuokaMonte CarloMorganNAVECONissanNobleNysaOldsmobileOpelOscaPaganiPanozPaykanPeroduaPeugeotPlymouthPontiacPorschePremierProtonPumaQorosQvaleRAFReliantRenaultRolls-RoyceRonartRoverSaabSaleenSamsungSantanaSaturnScionSEATShifengShuangHuanSkodaSMASmartSokonSoueastSpectreSpykerSsangYongSubaruSuzukiTalbotTataTatraTeslaTianmaTianyeTofasToyotaTrabantTVRVauxhallVectorVenturiVolkswagenVolvoVortexWartburgWestfieldWiesmannWulingXin KaiYuejinZastavaZXБогданВездеходы TingerВИСГАЗГуранЗАЗЗИЛИЖКАМАЗЛуАЗМосквичСеАЗСМЗТагАЗУАЗ

DACAR Бухарестская LadaLADA ЦЕНТР НОЯБРЬСК (ЛАДА ЯМАЛ)SPB-MotorsАбсолют Lada на ДорожнойАВД Групп LadaАвто 1Авто 1Авто 68АВТО ВЕК Акцент Авто МАвто Град КемеровоАвто Град НовокузнецкАвто Сити ВАЗ (Lada)Авто ТехнаАвто-1Авто-Дом на НовосулажгорскойАвто-Дом НовосулажгорскаяАвто-ПланетаАвтоАвангард LadaАВТОАРСЕНАЛ-ТАвтобан Восток ЛадаАвтобан КаменскАвтобан-БерезовскийАВТОВАЗТРАНСАвтовекАвтоВОЯЖАвтоГЕРМЕС KIA Ярославское ш. АвтоГЕРМЕС Варшавское ш.АвтоГЕРМЕС Волгоградский пр.АвтоГЕРМЕС Дмитровское ш.АвтоГЕРМЕС на ш. ЭнтузиастовАвтоГЕРМЕС ПодольскАвтоГЕРМЕС Ярославское ш.АВТОГРАД ЛискиАвтоГрад МоторсАвтоГусар (Маркетинг Бюро)АвтоГэмблАвтодвор+АвтоДягилевоАвтозаводская СТОАвтоКанищево LadaАвтокомплексАвтокомплекс ТомскАвтокредит-36АвтоЛайн LadaАвтоЛайтАВТОЛИГА на МаяковскогоАвтоМАШ LadaАвтомирАвтомир ГлазовАвтомир на ЕнисейскойАвтомир на ЭнгельсаАвтомобильный центр на ГурзуфскойАвтомобильный центр на МаневровойАвтомоллАвтоПрестижАвтопрофильАвтоРай Центр LadaАвтоРеалАвторегионАвтоРезерв LadaАвторитетАвтосалон «Авто 1″АвтостарАвтоТехИнвестАвтоторг LadaАвтоТракт ЛадаАвтоТракт на КуйбышеваАвтофирма СветланаАвтофристайл МАвтоцентр АНТ Lada на ЗмеиногорскийАвтоцентр ВиражАвтоцентр ВладимирАвтоцентр Дюк и К LadaАвтоцентр Енисей ЛадаАВТОЦЕНТР ЗАПАДНЫЙАвтоцентр ИЮЛЬАВТОЦЕНТР ЛАДА АВТОВОАВТОЦЕНТР на ЗаводскомАвтоцентр на ХилокскойАвтоцентр РучьиАвтоцентр-Лада ПлюсАвтоцентр-Тольятти-ВАЗАВТОЦЕНТРГАЗ АВТОВОАВТОЦЕНТРГАЗ НЕВСКИЙАВТОЦЕНТРГАЗ ЮЖНЫЙАГАТ ПлюсАгат-Авто ВолгоградАГРОЛАДАСЕРВИСАдыгея-ЛадаАЗИНО АВТОАлтай-ЛадаАльтернатива Плюс LadaАльянс Авто ШарьяАльянс-ЛадаАМ КомпаниАМК Волгоград LadaАмур ЛадаАнКАрмавирский Автоцентр ПлюсАрсеньевАвтоСервисАртекс на МалиновскогоАТ ЦЕНТР МАРИЙ ЭЛ LadaАтлантик Лада на ТаганскойАураАура АвтодомАура Автодом филиалАура-ТехноАЦ Терминал Моторс СоветскаяБалаково Сервис ЛадаБалашов-ЛадаБашАвтоКомБелгород-ЛадаБратск АВТОДИЛЕРБрянск-ЛадаБугач-АвтоБугуруслан ЛадаБурятАВТО LadaБЦР Авто ПлюсВасилеостровский LadaВЕКТОР-АВТОВерона Моторс LadaВерона Моторс КомиВершина-ЛадаВиражВИРАЖ ДзержинскогоВираж ЧерноисточинскоеВлада автоВолжский ЛадаВоронежавтогазсервис ДзержинскогоВЧ СервисГайва ЛадаГалс-КвадроГорячеводск Lada на ПочтовойГорячеводск Lada на СоветскойДав Авто ТрейдДайнава Лада ВоронежДВИМАВТОДВИМАВТО на ЦелиннаяДВИМАВТО ЯнаулДиал-АвтоДиалог-ИнвестДимар-Викинги LadaДинамика Авто СпортивнаяДон-экспрессДП Ставрополь Лада Ипатово ЛадаЗаводоуковск-ЛадаИваново ЛадаИнкомсервис LadaИнтей ЛадаИНТЕРИшим-ЛадаКавВАЗинтерСервисКавказ ЛадаКалуга-ЛадаКаменск-ЛадаКамчатремтех сервисКАН АВТО на Сибирском трактеКанск ЛадаКАРМЕНКАСПИЙгазавтосервис LadaКолесо LadaКордном Lada ГАРАНТКострома Лада СервисКрасная БашкирияКрасноярск ЛадаКристалл на Аксайском LadaКрумб СервисКубань ЛадаКузбасс ЛадаКузнецк ЛадаКурск-ЛадаЛада Авто АрзамасЛада Авто в ВыксеЛада Авто на БоруЛада Авто на Гагарина 105Лада Авто на Гагарина 232Лада Авто на КировскойЛада Авто на МещерскомЛада Авто на РодионоваЛада БестЛада и КЛада Интер Сервис НовороссийскЛада КонсулЛада СервисЛАДА СЕРВИС НерюнгриЛада ЦентрЛада Центр АвиамоторнаяЛада Центр МытищиЛада-Авто ПлюсЛада-АзияЛада-МаркетЛада-Центр КупчиноЛадья АВТО ВАЗ (Lada)ЛАЛ КомпаниЛАУРА КИРИШИЛегион моторсЛидер Авто на КироваЛидер Авто на ХасаншинойЛипецк ВикингиЛипецк ЛадаЛюкс АвтоМАКС Моторс ситиМартен Авто на ГагаринаМашинный дворМега МоторсМика МоторМир Авто ВолжскийМир-АвтОМОБИЛОН LadaМОТОРМста-ЛадаМуромавтосервисНальчик АВТОВАЗНефтетранссервисНижнекамск Лада СервисНовАвто LadaНовая ЭраНовосибирск ЛадаНорд Авто LadaНорд Авто РжевОка ЛадаОлимп Авто на КольскомОмск ЛадаОренбургсервисОрехово АвтоЦентр LadaОрск-ЛадаОСА ХолдингП сервис АлексиковскийП сервис ЛогиноваП сервис ЧернышковскийП-сервис LadaПарнас-ЛадаПарус КазаньПатриотПенза Авто LadaПерспектива НПетрозаводск ЛадаПитер-ЛадаПКФ ВиконТПоладПоладАвтоПензаПРАЙД Lada МожгаПРАЙД Lada СарапулПреголь-ЛадаПремьер Авто LadaПрогресс LadaПрогресс-МоторсПсков ЛадаПурпе-МоторсРегион-ТываРегионЛАДАРОНА ТольяттиРОНА Тольятти LadaРосАвтоРостов-ЛадаРосТулаАвтоРусь-АвтоРусьАвто на КулаковаРязань АвтоСамара Лада филиал БезенчукСамара-Авто LadaСамара-ЛадаСамара-ЛадаСаранск ЛадаСаратов ЛадаСевер Авто LadaСевер Авто ПлюсСевер Авто СервисСевер Авто Сервис ГледенскаяСевер-Лада МоторсСервис-АСимбирск-ЛадаСКАРТ сервисСКС Лада на НезависимостиСЛК Моторс Север АВТОВАЗ ЛадаСловоСмоленск ЛадаСОКОЛ LadaСПАРЗСпецАВТОцентр Хабаровск ВАЗСтаврополь-ЛадаСтавропольагротрансСтандарт-ЮгСТО КомсомольскаяСТО МихайловкаСТОАСура ЛадаСура Моторс АвтоСура Моторс авто LadaСыктывкар ЛадаТаврия-Авто на КиевскойТамбов Авто СитиТЕМП АВТОТемп Авто КубаньТемп Авто на РостовскомТехинком LadaТехсервис LadaТимашевск ЛадаТобольск-ЛадаТомь ЛадаТРАНСАВТО LadaТРАНСФОР КраснодарТРАНСФОР ЛАДА ОбводнаяТСС АрзамасТСС ВеденяпинаТСС КавказТТС Набережные Челны LadaТТС Уфа LadaТТЦ Автомаркет на Шоссейной 6ТулаавтосервисТФ Владомир Lada на СувороваТюмень АВТОВАЗУНИВЕРСАЛУрал БЭСТ-ИнвестУрал ЛадаУфа-АВТОВАЗУфа-АВТОВАЗ ЮГФАВОРИТ ЦветочнаяФактФеникс-Авто НМФирма ФобосФобосФорвард АвтоФорвард АвтоФорвард Авто на ОкуловаЦентр-МоторсЦентральная СТОЧебоксары ЛадаЧелябинск ЛадаЧелябинск Лада СТОЧеченавтоЧистополь-АвтоЭкипаж на СкачковскаяЭкипаж-2ЭКС АВТО КосмонавтовЭКС АВТО на СпешиловаЭКС АВТО Пермь LadaЭКС АВТО филиал БерезникиЭКС АВТО филиал УральскаяЭКС АВТО филиал ЧернушкаЭкспо Кар FAW ЛадожскаяЭкспо Кар СпортивнаяЭкспресс-Авто КропоткинЭлвис АКомЭлвис АКом на СпартакаЭлиста ЛадаЮг Лада МоторсЮг-Авто на ул. Уральская LadaЮг-АвтокомплектЮжноуральск ЛадаЮмакс-ЗЭТРОНЮникорЯрЛадасервисЯхрома Лада

Этого дилера я:

Рекомендую

Не рекомендую

Новый биосенсор на основе FRET для измерения активности BCR-ABL и его реакции на лекарства в живых клетках

. 2010 1 августа; 16 (15): 3964-75.

doi: 10.1158/1078-0432.CCR-10-0548.

Тацуаки Мизутани ¹ , Такеши Кондо, Стефани Дарманин, Масуми Цуда, Шинья Танака, Минору Тобиуме, Масахиро Асака, Юсуке Охба

Принадлежности

принадлежность

• ¹ Лаборатория патофизиологии и передачи сигналов Высшей школы медицины Университета Хоккайдо, Кира-ку, Саппоро, Япония.

• PMID: 20670950
• DOI: 10. 1158/1078-0432.ЦКР-10-0548

Бесплатная статья

Тацуаки Мизутани и др. Клин Рак Рез. 2010 .

Бесплатная статья

. 2010 1 августа; 16 (15): 3964-75.

doi: 10.1158/1078-0432.CCR-10-0548.

Авторы

Тацуаки Мизутани ¹ , Такеши Кондо, Стефани Дарманин, Масуми Цуда, Шинья Танака, Минору Тобиуме, Масахиро Асака, Юсуке Охба

принадлежность

• ¹ Лаборатория патофизиологии и передачи сигналов Высшей школы медицины Университета Хоккайдо, Кира-ку, Саппоро, Япония.

• PMID: 20670950
• DOI: 10.1158/1078-0432.ЦКР-10-0548

Абстрактный

Цель: Чтобы разработать новый диагностический метод для оценки эффективности лекарств у пациентов с хроническим миелоидным лейкозом (ХМЛ) индивидуально, мы создали биосенсор, который позволяет оценивать активность киназы BCR-ABL в живых клетках, используя принцип резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET). .

Экспериментальная дизайн: Для разработки биосенсоров на основе FRET мы использовали CrkL, наиболее характерный субстрат BCR-ABL, и разработали белок, в котором CrkL зажат между Venus, вариантом YFP, и улучшенным голубым флуоресцентным белком, так что внутримолекулярное связывание CrkL с Домен Sh3 фосфорилированного тирозина (Y207) увеличивает эффективность FRET. После оценки свойств этого биосенсора в сравнении с общепринятыми методами, включая Вестерн-блоттинг и проточную цитометрию, активность BCR-ABL и его реакцию на лекарственные средства исследовали в клетках пациентов с ХМЛ.

Полученные результаты: После оптимизации мы получили биосенсор, обладающий более высокой чувствительностью, чем у известных методик, в отношении измерения активности BCR-ABL и ее подавления иматинибом. Благодаря своей высокой чувствительности этот биосенсор точно измеряет активность BCR-ABL в относительно небольшом количестве клеток, а также может обнаруживать менее 1% популяций с незначительной лекарственной устойчивостью в гетерогенных популяциях. Мы также заметили, что этот метод позволил нам предсказать возникновение лекарственной устойчивости в будущем, а также контролировать состояние болезни во время терапии иматинибом, используя клетки пациента.

Вывод: Принимая во внимание его быстрый и практичный характер, этот метод потенциально является многообещающим инструментом для прогнозирования как текущих, так и будущих терапевтических ответов у отдельных пациентов с ХМЛ, что, безусловно, будет полезно как для пациентов, так и для клиницистов.

Похожие статьи

• Уровни фосфорилирования BCR-ABL, CrkL, AKT и STAT5 в резистентных к иматинибу клетках хронического миелоидного лейкоза предполагают использование альтернативного пути в качестве стратегии выживания.

  Джилани И., Кантарджян Х., Горре М., Кортес Дж., Оттманн О., Бхалла К., Джайлз Ф.Дж., Альбитар М. Джилани I и др. Лейк Рез. 2008 апр; 32 (4): 643-9. doi: 10.1016/j.leukres.2007.08.009. Epub 2007, 27 сентября. Лейк Рез. 2008. PMID: 17

  6

• Быстрое обнаружение белков фосфотирозина с помощью проточного цитометрического анализа в Bcr-Abl-положительных клетках.

  Деспла В., Лагард В., Беллок Ф., Шолле С., Легэ Т., Паске Ж.М., Пралоран В., Махон Ф.Х. Деспла В и др. Цитометрия А. 2004 ноябрь; 62(1):35-45. doi: 10.1002/cyto.a.20030. Цитометрия А. 2004. PMID: 15468123

• [Клиническое значение уровня фосфорилирования белка CRKL при лечении хронического миелоидного лейкоза иматинибом].

  Сюй Н, Оуян З, ДУ ЦФ, Ван С, Ян Дж, Ван И, Лю СL. Сюй Н и др. Чжунхуа Сюэ Йе Сюэ За Чжи. 2011 Январь; 32 (1): 25-8. Чжунхуа Сюэ Йе Сюэ За Чжи. 2011. PMID: 21429397 Китайский язык.

• Новые таргетные методы лечения для преодоления резистентности к мезилату иматиниба при хроническом миелоидном лейкозе (ХМЛ).

  Уолз С., Саттлер М. Уолз С и др. Crit Rev Oncol Hematol. 2006 г., февраль; 57 (2): 145–64. doi: 10.1016/j.critrevonc.2005.06.007. Epub 2005 5 октября. Crit Rev Oncol Hematol. 2006. PMID: 16213151 Обзор.

• Важные терапевтические мишени при хроническом миелогенном лейкозе.

  Кантарджян Х.М., Джайлз Ф., Квинтас-Кардама А., Кортес Дж. Кантарджян Х.М. и др. Клин Рак Рез. 2007 15 февраля; 13 (4): 1089-97. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-06-2147. Клин Рак Рез. 2007. PMID: 17317816 Обзор.

Посмотреть все похожие статьи

Типы публикаций

термины MeSH

вещества

Биосенсор FRET на основе домена Sh3 для измерения активности BCR-ABL в живых клетках ХМЛ

2017

Авторы:

Мари Фудзиока ² ,

Юми Асано ¹ ,

Шигеюки Накада ¹ ,

Юсуке Охба ²

Мари Фудзиока ² ,

Юми Асано ¹ ,

Шигеюки Накада ¹ ,

Юсуке Охба ²

показать подробности

Серия: Методы молекулярной биологии > Книга: Sh3 Domains

Протокол | DOI: 10. 1007/978-1-4939-6762-9_30

Филиалы:

1. Технологический центр Тамано, Штаб-квартира исследований и разработок, Mitsui Engineering & Shipbuilding Co., Ltd., Тамано, Япония
2. Кафедра клеточной физиологии, Высшая школа медицины Университета Хоккайдо, Саппоро, Япония

меньше

Доступ разрешен через: Учреждение

PDF Полный текст Статьи по теме

Abstract

Флуоресцентные белки (FP), демонстрирующие различные спектры, пролили свет на широкий спектр биологических функций. Более того, сложные биосенсоры, спроектированные так, чтобы содержать один или несколько FP, включая резонансную передачу энергии Фёрстера

 …подробнее

Флуоресцентные белки (FP), демонстрирующие различные спектры, пролили свет на широкий спектр биологических функций. Более того, сложные биосенсоры, спроектированные так, чтобы содержать один или несколько FP, в том числе биосенсоры на основе резонансного переноса энергии Фёрстера (FRET), пространственно-временно выявляют молекулярные механизмы, лежащие в основе различных патофизиологических процессов. Однако их полезность для прикладных наук о жизни еще предстоит полностью изучить. В последнее время наша исследовательская группа начала расширять потенциал FP от фундаментальных биологических исследований до клиники. Здесь мы описываем метод оценки реакции лейкозных клеток пациентов на ингибиторы тирозинкиназы с использованием биосенсора на основе технологии FP и принципа FRET. При фосфорилировании остатка тирозина биосенсора связывание домена Sh3 с фосфотирозином индуцирует конформационные изменения биосенсора и сближает донорные и акцепторные FP. Следовательно, активность киназы и реакцию на ингибиторы киназы можно контролировать по увеличению и уменьшению эффективности FRET соответственно. Как и в фундаментальных исследованиях, этот биосенсор решает сложные до сих пор задачи и может обеспечить инновационные технологические достижения в клинических лабораторных исследованиях. Также внедряются современные устройства обнаружения, которые позволяют такие инновации.

меньше

Рисунки (0) и видео (0)

Ключевые слова

Техники:

FRET, флуоресцентная микроскопия, биосенсорная техника, разделение и изоляция клеток, трансфекция, микроскопия, проточная цитометрия, метаморф, FACS, культура клеток и тканей, стерилизация, лизис клеток, анализ данных

Модели:

Кишечная палочка, объектив, К.М.Л.

Другие:

БКР-АБЛ, Время жизни флуоресценции, Флуоресцентный белок (FP), Хронический миелоидный лейкоз (ХМЛ), молекулярный целевой препарат, КркЛ, Флуоресцентная цитометрия (FCM), Домен Src Homology 2 (Sh3)

Статьи по теме

На основе методов

Ссылки

1. Morise H, Shimomura O, Johnson F и др. (1974) Межмолекулярный перенос энергии в биолюминесцентной системе Aequorea. Биохимия 13: 2656–2662.
2. Prasher D, Eckenrode V, Ward W et al (1992) Первичная структура зеленого флуоресцентного белка Aequorea victoria. Бытие 111: 229–233.
3. Heim R, Prasher DC, Tsien RY (1994)Мутации длины волны и посттрансляционное самоокисление зеленого флуоресцентного белка. Proc Natl Acad Sci U S A 91:12501–12504
4. Мизутани Т., Кондо Т., Дарманин С. и др. (2010) Новый биосенсор на основе FRET для измерения активности BCR-ABL и его реакции на лекарства в живых клетках. Клин Рак Рез 16:3964–3975
5. Kurzrock R, Estrov Z, Kantarjian H et al (1998) Превращение индуцированных интерфероном долгосрочных цитогенетических ремиссий при хроническом миелогенном лейкозе в отрицательную полимеразную цепную реакцию. Дж. Клин Онкол 16: 1526–1531
6. Groffen J, Stephenson JR, Heisterkamp N et al (1984) Филадельфийские точки разрыва хромосом сгруппированы в пределах ограниченной области, bcr, на хромосоме 22. Cell 36:93–99
7. Heisterkamp N, Groffen J, Stephenson JR и др. (1982) Хромосомная локализация человеческих клеточных гомологов двух вирусных онкогенов. Природа 299: 747–749

Abstract

Флуоресцентные белки (FP), демонстрирующие различные спектры, пролили свет на широкий спектр биологических функций. Кроме того, сложные биосенсоры, спроектированные так, чтобы содержать один или несколько FP, включая резонансную передачу энергии Фёрстера

 …подробнее

Флуоресцентные белки (FP), демонстрирующие различные спектры, пролили свет на широкий спектр биологических функций. Более того, сложные биосенсоры, спроектированные так, чтобы содержать один или несколько FP, в том числе биосенсоры на основе резонансного переноса энергии Фёрстера (FRET), пространственно-временно выявляют молекулярные механизмы, лежащие в основе различных патофизиологических процессов. Однако их полезность для прикладных наук о жизни еще предстоит полностью изучить. В последнее время наша исследовательская группа начала расширять потенциал FP от фундаментальных биологических исследований до клиники. Здесь мы описываем метод оценки реакции лейкозных клеток пациентов на ингибиторы тирозинкиназы с использованием биосенсора на основе технологии FP и принципа FRET. При фосфорилировании остатка тирозина биосенсора связывание домена Sh3 с фосфотирозином индуцирует конформационные изменения биосенсора и сближает донорные и акцепторные FP. Следовательно, активность киназы и реакцию на ингибиторы киназы можно контролировать по увеличению и уменьшению эффективности FRET соответственно. Как и в фундаментальных исследованиях, этот биосенсор решает сложные до сих пор задачи и может обеспечить инновационные технологические достижения в клинических лабораторных исследованиях. Также внедряются современные устройства обнаружения, которые позволяют такие инновации.

меньше

Связанные статьи

На основе методик

Ссылки

1. Morise H, Shimomura O, Johnson F et al (1974) Межмолекулярный перенос энергии в биолюминесцентной системе Aequorea. Биохимия 13: 2656–2662.
2. Prasher D, Eckenrode V, Ward W et al (1992) Первичная структура зеленого флуоресцентного белка Aequorea victoria. Бытие 111: 229–233.
3. Хайм Р., Прашер, округ Колумбия, Цзянь Р.Ю. (1994) Мутации длины волны и посттрансляционное автоокисление зеленого флуоресцентного белка. Proc Natl Acad Sci U S A 91:12501–12504
4. Мизутани Т., Кондо Т., Дарманин С. и др. (2010) Новый биосенсор на основе FRET для измерения активности BCR-ABL и его реакции на лекарства в живых клетках. Clin Cancer Res 16: 3964–3975
5. Kurzrock R, Estrov Z, Kantarjian H et al (1998) Превращение индуцированных интерфероном долгосрочных цитогенетических ремиссий при хроническом миелогенном лейкозе в отрицательную полимеразную цепную реакцию. Дж. Клин Онкол 16: 1526–1531
6. Groffen J, Stephenson JR, Heisterkamp N et al (1984) Филадельфийские точки разрыва хромосом сгруппированы в пределах ограниченной области, bcr, на хромосоме 22. Cell 36:93–99
7. Heisterkamp N, Groffen J, Stephenson JR et al (1982) Хромосомная локализация человеческих клеточных гомологов двух вирусных онкогенов. Природа 299: 747–749

Рисунки (0) и видео (0)

Реклама

Ключевые слова

Техника:

FRET, флуоресцентная микроскопия, биосенсорная техника, разделение и изоляция клеток, трансфекция, микроскопия, проточная цитометрия, метаморф, FACS, культура клеток и тканей, стерилизация, лизис клеток, анализ данных

Модели:

Кишечная палочка, объектив, К.М.Л.

Другие:

БКР-АБЛ, Время жизни флуоресценции, Флуоресцентный белок (FP), Хронический миелоидный лейкоз (ХМЛ), молекулярный целевой препарат, КркЛ, Флуоресцентная цитометрия (FCM), Домен Src Homology 2 (Sh3)

Рисунки и данные в Конформационное изменение во внеклеточном домене В-клеточного рецептора при активации В-клеток при связывании антигена

• Статья
• Цифры и данные
• Цифры
• Дополнительные файлы

15 рисунки и 1 дополнительный файл

рисунки

Сайт-специфическое мечение тяжелой цепи mIg IgM-BCR.

( A ) Схематическое изображение VRC01-IgM-BCR с двойной меткой. Метка ybbR, встроенная в N-конец тяжелой цепи IgM, меченная CoA 488, показана красным кружком, а тетрацистеиновая метка в области Cμ2 тяжелой цепи IgM, меченной ReAsH, показана коричневым кружком. ( B ) Репрезентативные конфокальные изображения WT и VRC01-IgM-BCR с двойной меткой, экспрессированных в клетках 293T. Метка ybbR и тетрацистеиновая метка окрашивались CoA 488 и ReAsH соответственно. Alexa Fluor 647 (AF647) Fab-фрагмент козьего античеловеческого IgM Fc5μ использовали для окрашивания BCR. Масштабная линейка, 5 мкм. ( C ) WT и VRC01-IgM-BCR с двойной меткой, экспрессирующие клетки 293T, связывающиеся с мономерным антигеном V51. Клетки 293T без экспрессии BCR использовали в качестве контроля. ( D ) Ca ²⁺ Анализ мобилизации В-клеток A20II1.6, экспрессирующих WT и VRC01-IgM-BCR с двойной меткой, стимулированных тримерным антигеном V51.

https://doi.org/10.7554/eLife.42271.002

Сайт-специфическое мечение тяжелой цепи mIg IgG-BCR.

( A ) Схематическое изображение VRC01-IgG-BCR с двойной меткой. Метка ybbR, встроенная в N-конец тяжелой цепи IgG, меченная CoA 488, показана красным кружком, а тетрацистеиновая метка в области Cγ2 тяжелой цепи IgG, меченной ReAsH, показана коричневым кружком. ( B ) Репрезентативные конфокальные изображения WT и VRC01-IgG-BCR с двойной меткой, экспрессированных в клетках 293T. Метка ybbR и тетрацистеиновая метка окрашивались CoA 488 и ReAsH соответственно. Alexa Fluor 647 (AF647) Fab-фрагмент козьего античеловеческого IgG Fcγ использовали для окрашивания BCR. Масштабная линейка, 5 мкм. ( C ) WT и VRC01-IgG-BCR с двойной меткой, экспрессирующие клетки 293T, связывающиеся с мономерным антигеном V51. Клетки 293T без экспрессии BCR использовали в качестве контроля. ( D ) Анализ мобилизации Ca ²⁺ В-клеток A20II1.6, экспрессирующих WT и VRC01-IgG-BCR с двойной меткой, стимулированных тримерным антигеном V51. ( E ) Слева: Электрофорез в нативном голубом полиакриламидном геле (BN-PAGE). Мономер и тример V51 с меткой His анализировали в невосстанавливающих условиях. Справа: вестерн-блоттинг. Мономер и тример V51, меченный His, анализировали с использованием антитела против His-метки в восстанавливающих условиях. ( F ) Ca ²⁺ Анализ мобилизации В-клеток Ramos, экспрессирующих WT VRC01-IgM-BCR, стимулированных тримерным или мономерным антигеном V51.

https://doi.org/10.7554/eLife.42271.003

Экспрессия дикого типа и меченого растворимого мономера VRC01-IgM.

( A–B ) SDS-PAGE ( A ) и BN-PAGE ( B ) дикого типа и растворимого VRC01-IgM с двойной меткой. ( C ) WT и растворимый VRC01-IgM с двойной меткой могут связываться с клетками 293T, экспрессирующими gp120. Клетки инкубировали с WT или растворимым VRC01-IgM с двойной меткой с последующим окрашиванием AF647 против человеческого IgM Fc5μ. Клетки 293T без экспрессии gp120 использовали в качестве контроля. ( D ) Растворимый VRC01-IgM с двойной меткой может быть помечен CoA 488 и ReAsH одновременно.

https://doi.org/10.7554/eLife.42271.004

Конформационное изменение тяжелой цепи mIg VRC01-IgM-BCR при контакте с антигеном.

( A ) Схематическая иллюстрация, показывающая эффективность FRET между меткой CoA 488 на N-конце (красный кружок) и меткой ReAsH в домене Cμ2 (коричневый кружок) VRC01-IgM-BCR с двойной меткой. ( B ) Схематическая иллюстрация, показывающая мономер V51, слитый с полигистидиновой меткой, присутствующий на поверхности Ni ²⁺ -содержащих плоских липидных бислойных (PLB) мембран на поддерживаемых покровных стеклах. ( C – D ) Дегашение FRET для измерения эффективности FRET между CoA 488 и ReAsH в клетках 293T, экспрессирующих VRC01-IgM-BCR с двойной меткой, активированный мономерным антигеном V51. Были показаны репрезентативные изображения TIRFM V51-активированных и неактивированных клеток 293T. Клетки с равной интенсивностью донора и равной интенсивностью акцептора использовали для анализа FRET. Масштабная линейка составляет 5 мкм. Данные взяты по крайней мере из 34 клеток в пяти независимых экспериментах. Q: утолить; ДК: разогнать. ( E–H ) FLIM-FRET для измерения эффективности FRET между CoA 488 и ReAsH VRC01-IgM-BCR с двойной меткой, экспрессируемого в клетках 293T, стимулированных мономерным антигеном V51. ( E ) Были показаны репрезентативные FLIM-изображения V51-активированных и неактивированных клеток 293T, окрашенных только донором (CoA 488) или окрашенных донором и акцептором (CoA 488 + ReAsH). Масштабная линейка составляет 3 мкм. ( F–G ) Время жизни флуоресценции и эффективность FRET на основе времени жизни клеток VRC01-IgM-BCR с двойной меткой, экспрессирующих клетки 293T. ( H ) Распределение эффективности FRET для всех измеренных молекул VRC01-IgM-BCR с двойной меткой. Данные взяты как минимум из 11 ячеек. ( I ) Дегашение FRET для измерения эффективности FRET между CoA 488 и ReAsH в В-клетках A20II1.6, экспрессирующих VRC01-IgM-BCR с двойной меткой, активированных мономерным антигеном V51. Клетки с равной интенсивностью донора и равной интенсивностью акцептора использовали для анализа FRET. Данные взяты как минимум из 28 ячеек. ( J ) Связь эффективности FRET между CoA 488 и ReAsH со средней интенсивностью p-Igα, рекрутируемого в иммунологический синапс в A20II1.6 B-клетках, была указана с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена (r). Столбики погрешностей представляют собой среднее ± SEM. Двусторонние t-критерии использовались для статистических сравнений. ***р<0,001; **р<0,01.

https://doi.org/10.7554/eLife.42271.005

Конформационное изменение в тяжелой цепи mIg VRC01-IgM-BCR при контакте с антигеном в основном связано с изменением внутримолекулярного FRET.

( А–Б ) Схематическая иллюстрация, показывающая процесс деконволюции межмолекулярного и внутримолекулярного FRET. Вкратце, меченые VRC01-IgM-BCR разбавляли WT VRC01-IgM-BCR для минимизации межмолекулярного FRET. В ситуации, когда две метки находятся в одной плазмиде для экспрессии BCR с двойной меткой ( A ), большая часть наблюдаемого сигнала FRET будет внутримолекулярной FRET. В ситуации, когда две метки находятся в двух разных плазмидах для экспрессии двух типов BCR с одной меткой ( B ), соответственно, большая часть наблюдаемого сигнала FRET будет межмолекулярной FRET. ( C–F ) Дегашение FRET для измерения эффективности FRET между CoA 488 и ReAsH в клетках 293T, экспрессирующих меченый VRC01-IgM-BCR, активированный мономерным антигеном V51. Были показаны внутримолекулярный FRET между CoA 488 и ReAsH в одной и той же отдельной молекуле VRC01-IgM-BCR ( C ) и межмолекулярный FRET между CoA 488 и ReAsH в двух соседних молекулах VRC01-IgM-BCR ( D ). Также были показаны внутримолекулярная FRET ( E ) и межмолекулярная FRET ( F ) между CoA 488 и ReAsH без разбавления. Клетки с равной интенсивностью донора и равной интенсивностью акцептора использовали для анализа FRET. Данные взяты по крайней мере из 21 клетки в трех независимых экспериментах. Двусторонние t-критерии использовались для статистических сравнений. ***р<0,001; **р<0,01.

https://doi.org/10.7554/eLife.42271.006

Конформационное изменение в тяжелой цепи Ig растворимого мономера VRC01-IgM при контакте с антигеном.

( A ) Схематическое изображение связывания растворимого мономера VRC01-IgM с мономером V51, представленным на поверхности Ni ²⁺ -содержащие мембраны PLB на покровных стеклах. ( B–C ) Дегашение FRET для измерения эффективности FRET между CoA 488 и ReAsH в растворимом VRC01-IgM с двойной меткой. Были показаны репрезентативные конфокальные изображения активированных V51 и неактивированных растворимых молекул VRC01-IgM на покровном стекле. Данные взяты как минимум из 13 изображений (38,5 × 38,5 мкм). ( D–G ) FLIM-FRET для измерения эффективности FRET между CoA 488 и ReAsH растворимых молекул VRC01-IgM-BCR с двойной меткой, стимулированных мономерным антигеном V51. ( D ) Были показаны репрезентативные FLIM-изображения V51-активированных и неактивированных растворимых молекул VRC01-IgM, окрашенных только донором (CoA 488) или окрашенных донором и акцептором (CoA 488 + ReAsH). Шкала бара составляет 8 мкм. ( E – F ) Время жизни флуоресценции и эффективность FRET на основе времени жизни растворимых молекул VRC01-IgM-BCR с двойной меткой. Данные взяты как минимум из шести изображений (30 × 30 мкм). ( G ) Распределение эффективности FRET для всех измеренных молекул VRC01-IgM-BCR с двойной меткой. Столбики погрешностей представляют собой среднее ± SEM. Двусторонние t-критерии использовались для статистических сравнений.

https://doi.org/10.7554/eLife.42271.007

Конформационное изменение тяжелой цепи mIg зависит от цитоплазматического хвоста.

( A ) Схематическое изображение различных типов VRC01-BCR, оснащенных разными цитоплазматическими хвостами. Исследовали эффективность FRET между меткой CoA 488 на N-конце (красный кружок) и ReAsH в домене Cμ2 (или части Cγ2, коричневый кружок) VRC01-BCR с двойной меткой. ( B ) Дегашение FRET для измерения эффективности FRET между CoA 488 и ReAsH в клетках 293T, экспрессирующих VRC01-BCR с двойной меткой, активированный мономерным антигеном V51. Слева направо: IgM, MMG, IgG, GGM. Столбики погрешностей представляют собой среднее ± SEM. Данные взяты по крайней мере из 19 клеток в течение двух независимых экспериментов. Двусторонние t-критерии использовались для статистических сравнений. ***р<0,001.

https://doi.org/10.7554/eLife.42271.008

Конформационное изменение тяжелой цепи mIg зависит от цитоплазматического хвоста.

( A-B ) Клетки с одинаковой интенсивностью донора ( A ) и равной интенсивностью акцептора ( B ) использовали для анализа FRET. Слева направо: IgM, MMG, IgG, GGM. ( C – D ) Дегашение FRET для измерения эффективности FRET между CoA 488 и ReAsH в клетках 293T, экспрессирующих VRC01-BCR с двойной меткой в ​​отсутствие антигена. ( C ) Сравнение IgM и MMG; ( D ) сравнение IgG и GGM. Столбики погрешностей представляют собой среднее ± SEM. Двусторонние t-критерии использовались для статистических сравнений.

https://doi.org/10.7554/eLife.42271.009

Конформационное изменение тяжелой цепи mIg зависит от цитоплазматического хвоста.

( A–B ) Двусторонний ANOVA использовали для анализа эффекта взаимодействия между цитоплазматическим хвостом Ig и вовлечением антигена. Двусторонний ANOVA с поправкой Сидака для множественных сравнений использовался для статистического сравнения между каждой группой. ( A ) Сравнение между IgM и MMG; ( B ) сравнение IgG и GGM. ( C–D ) Для анализа использовали клетки с сопоставимой интенсивностью флуоресценции донора и акцептора. Был применен односторонний ANOVA. ( C ) Сравнение IgM и MMG; ( D ) сравнение IgG и GGM. ***р<0,001.

https://doi.org/10.7554/eLife.42271.010

Конформационное изменение пространственного соотношения между тяжелой цепью mIg и Igβ в VRC01-IgG-BCR при контакте с антигеном.

( A ) Схематическая иллюстрация, показывающая эффективность FRET между меткой ReAsH в Igβ (коричневый кружок) и меткой AF647 в области Fc (фиолетовый кружок) меченого VRC01-IgG-BCR. ( B–C ) Дегашение FRET для измерения эффективности FRET между ReAsH и AF647 в клетках 293T, экспрессирующих меченый VRC01-IgG-BCR, активированный мономерным антигеном V51. Были показаны репрезентативные изображения TIRFM V51-активированных и неактивированных клеток 293T. Клетки с равной интенсивностью донора и равной интенсивностью акцептора использовали для анализа FRET. Масштабная линейка составляет 5 мкм. Данные взяты по крайней мере из 30 клеток в течение двух независимых экспериментов. Q: утолить; ДК: разогнать. ( D–G ) FLIM-FRET для измерения эффективности FRET между ReAsH и AF647 меченого VRC01-IgG-BCR, экспрессируемого в клетках 293T, стимулированных мономерным антигеном V51. ( D ) Были показаны репрезентативные FLIM-изображения V51-активированных и неактивированных клеток 293T, окрашенных только донором (ReAsH) или окрашенных донором и акцептором (ReAsH + AF647). Масштабная линейка составляет 3 мкм. ( E – F ) Время жизни флуоресценции и основанная на времени жизни эффективность FRET меченых VRC01-IgG-BCR, экспрессирующих клетки 293T. ( G ) Распределение эффективности FRET всех измеренных меченых молекул VRC01-IgG-BCR. Данные взяты как минимум из девяти ячеек. ( H ) Дегашение FRET для измерения эффективности FRET между ReAsH и AF647 в В-клетках A20II1.6, экспрессирующих меченый VRC01-IgG-BCR, активированный мономерным антигеном V51. Клетки с равной интенсивностью донора и равной интенсивностью акцептора использовали для анализа FRET. Данные взяты как минимум из 24 ячеек. ( I ) Связь эффективности FRET между ReAsH и AF647 со средней интенсивностью p-Igα, привлеченного в иммунологический синапс в A20II1.6 B-клетках, была показана коэффициентом ранговой корреляции Спирмена (r). Столбики погрешностей представляют собой среднее ± SEM. Двусторонние t-критерии использовались для статистических сравнений. ***р<0,001; **р<0,01; *р<0,05.

https://doi.org/10.7554/eLife.42271.011

Сайт-специфическое мечение в Igβ IgM-BCR.

( A ) Схематическое изображение меченого VRC01-IgM-BCR. Тетрацистеиновая метка во внеклеточном домене Igβ, меченная ReAsH, показана коричневым кружком. Fab-фрагмент козьего античеловеческого IgM Fc5μ показан фиолетовым кружком. ( B ) Репрезентативные конфокальные изображения WT и меченого VRC01-IgM-BCR, экспрессированного в клетках 293T. Тетрацистеиновая метка окрашивалась ReAsH. Fc-фрагмент тяжелой цепи IgM окрашивали AF647 Fab-фрагментом козьего античеловеческого IgM Fc5μ. Масштабная линейка составляет 5 мкм. ( C ) WT и меченые VRC01-IgM-BCR, экспрессирующие клетки 293T, связывающиеся с мономерным антигеном V51. Клетки 293T без экспрессии BCR использовали в качестве контроля. ( D ) Анализ мобилизации Са2 + В-клеток A20II1.6, экспрессирующих WT и меченых VRC01-IgM-BCR, стимулированных тримерным антигеном V51.

https://doi. org/10.7554/eLife.42271.012

Сайт-специфическое мечение в Igβ IgG-BCR.

( A ) Схематическое изображение меченого VRC01-IgG-BCR. Метка тетрацистеина во внеклеточном домене Igβ показана коричневым кругом. Fab-фрагмент Fcγ козы против IgG человека показан фиолетовым кружком. ( B ) Репрезентативные конфокальные изображения WT и меченого VRC01-IgG-BCR, экспрессированного в клетках 293T. Тетрацистеиновая метка окрашивалась ReAsH. Fc-фрагмент тяжелой цепи IgG окрашивали Fcγ-фрагментом AF647 Fab козы против IgG человека. Масштабная линейка составляет 5 мкм. ( C ) WT и меченые VRC01-IgG-BCR, экспрессирующие клетки 293T, связывающиеся с мономерным антигеном V51. Клетки 293T без экспрессии BCR использовали в качестве контроля. ( D ) Анализ мобилизации Ca ²⁺ В-клеток A20II1. 6, экспрессирующих WT и меченых VRC01-IgG-BCR, стимулированных тримерным антигеном V51.

https://doi.org/10.7554/eLife.42271.013

Конформационное изменение пространственного соотношения между тяжелой цепью mIg и Igβ в VRC01-IgM-BCR при контакте с антигеном.

( A ) Схематическая иллюстрация, показывающая эффективность FRET между меткой ReAsH в Igβ (коричневый кружок) и меткой AF647 в области Fc (фиолетовый кружок) меченого VRC01-IgM-BCR. ( B–C ) Дегашение FRET для измерения эффективности FRET между ReAsH и AF647 в клетках 293T, экспрессирующих меченый VRC01-IgM-BCR, активированный мономерным антигеном V51. Были показаны репрезентативные изображения TIRFM V51-активированных и неактивированных клеток 293T. Клетки с равной интенсивностью донора и равной интенсивностью акцептора использовали для анализа FRET. Масштабная линейка составляет 5 мкм. Данные взяты по крайней мере из 20 клеток в течение двух независимых экспериментов. Q: утолить; ДК: разогнать.

https://doi.org/10.7554/eLife.42271.014

Конформационное изменение пространственного соотношения между тяжелой цепью mIg и Igβ зависит от цитоплазматического хвоста.

( A ) Схематическое изображение различных типов VRC01-BCR, оснащенных разными цитоплазматическими хвостами. Была обнаружена эффективность FRET между меткой ReAsH во внеклеточном домене Igβ (коричневый кружок) и меткой AF647 в части Fc (фиолетовый кружок) меченого VRC01-BCR. ( B ) Dequenching FRET для измерения эффективности FRET между ReAsH и AF647 в 29Клетки 3T, экспрессирующие меченый VRC01-BCR, активированный мономерным антигеном V51. Слева направо: IgM, MMG, IgG, GGM. Столбики погрешностей представляют собой среднее ± SEM. Данные взяты по крайней мере из 19 клеток в течение двух независимых экспериментов. Двусторонние t-критерии использовались для статистических сравнений. **р<0,01.

https://doi.org/10.7554/eLife.42271.015

Конформационное изменение пространственного соотношения между тяжелой цепью mIg и Igβ зависит от цитоплазматического хвоста.

( A-B ) Клетки с одинаковой интенсивностью донора ( A ) и равной интенсивностью акцептора ( B ) использовали для анализа FRET. Слева направо: IgM, MMG, IgG, GGM. Столбики погрешностей представляют собой среднее ± SEM. ( C–D ) Дегашение FRET для измерения эффективности FRET между ReAsH и AF647 в 29Клетки 3T, экспрессирующие меченый VRC01-BCR в отсутствие антигена. ( C ) Сравнение между IgM и MMG; ( D ) сравнение IgG и GGM. Двусторонние t-критерии использовались для статистических сравнений. **р<0,01; *р<0,05.

https://doi.org/10.7554/eLife.42271.016

Конформационное изменение пространственного соотношения между тяжелой цепью mIg и Igβ зависит от цитоплазматического хвоста.

( A–B ) Двусторонний ANOVA использовали для анализа эффекта взаимодействия между цитоплазматическим хвостом Ig и вовлечением антигена. Двусторонний ANOVA с поправкой Сидака для множественных сравнений использовался для статистического сравнения между каждой группой. ( A ) Сравнение между IgM и MMG; ( Б ) сравнение между IgG и GGM. ( C–D ) Для анализа использовали клетки с сопоставимой интенсивностью флуоресценции донора и акцептора. Был применен односторонний ANOVA. ( C ) Сравнение между IgM и MMG; ( D ) сравнение IgG и GGM. ***р<0,001; **р<0,01.

https://doi.org/10.7554/eLife.42271.017

Мультяшные модели конформационных изменений BCR.

( A ) Модель конформационного изменения активации IgM-BCR. При контакте с антигеном расстояние между N-концом и доменом Cμ2 в mIgM увеличивается, что может быть результатом растяжения или изгиба шарнирной области. Это конформационное изменение может инициировать потенциальное конформационное изменение в домене Fc, чтобы раскрыть интерфейс кластеризации в домене Cμ4. ( Б ) Модель конформационного изменения активации IgG-BCR. После связывания с антигеном потенциальное конформационное изменение в домене Cγ3 происходит независимо от изменения расстояния между N-концом и Cγ2 в mIgG. Затем близость между mIg и Igα/β уменьшается, что может быть связано с диссоциацией IgG между цитоплазматической плазматической мембраной хвоста. Воздействие интерфейса кластеризации в домене Cμ4 (или Cγ3) будет способствовать кластеризации BCR.

https://doi.org/10.7554/eLife.42271.018

Мечение метки ybbR в области Fc или Igα/β VRC01-IgM-BCR.

Схематическое изображение, показывающее среднее значение FRET между ReAsH, меченным Igβ, и поликлональным Fab-фрагментом антитела, конъюгированным с AF647, в области Fc.

Вверху: FRET между ReAsH и AF647 (связывание с Fc5μ IgM, который содержит большую часть области Cμ3/4) в IgM-BCR. Внизу: FRET между ReAsH и AF647 в IgG-BCR.

Репрезентативные изображения только донорских и только акцепторных образцов меченого VRC01-IgM-BCR до и после фотообесцвечивания акцептора.

Репрезентативные изображения только донорских (ReAsH, помеченных в Igβ) и только акцепторных (AF647 помеченных в области Fcγ) образцов меченого VRC01-IgG-BCR до и после фотообесцвечивания акцептора.

«Эффективность FRET» только в донорских (ReAsH, меченных в Igβ) и только акцепторных (AF647, меченных в области Fcγ) образцах меченого VRC01-IgG-BCR при контакте с антигеном.

Слева: только донорские образцы; Справа: акцептор только сэмплов.

Потенциальный ингибирующий эффект конформационных изменений между N-концом и доменом Cμ2 mIg в IgM-BCR.

Потенциальный активирующий эффект конформационного изменения между N-концом и доменом Cμ2 mIg в IgM-BCR.

Базальное сравнение FRET в BCR с отчетливым цитоплазматическим хвостом Ig с использованием двустороннего t-критерия.

Слева направо: IgM в сравнении с MMG на рисунке 3, IgG в сравнении с GGM на рисунке 3, IgM в сравнении с MMG на рисунке 5, IgG в сравнении с GGM на рисунке 5.

Были показаны эффективность

FRET, средняя интенсивность флуоресценции донора и средняя интенсивность флуоресценции акцептора до сопоставления интенсивности флуоресценции контрольной группы и антигенной группы.

Поскольку интенсивность флуоресценции донора в контрольной группе была значительно ниже, для дальнейшего анализа была выбрана подгруппа клеток с сопоставимой интенсивностью флуоресценции донора, как показано красным квадратом (вверху). Были показаны эффективность FRET, средняя интенсивность флуоресценции донора и средняя интенсивность флуоресценции акцептора после сопоставления интенсивности флуоресценции контрольной группы и группы антигена (внизу).

Дополнительные файлы

Ссылки для скачивания

Список ссылок, состоящий из двух частей, для загрузки статьи или частей статьи в различных форматах.